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半仙0356新蟲 (正式寫手)
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[求助]
反轉(zhuǎn)錄和PCR問題╭(°A°`)╮ 已有2人參與
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自己提的RNA，濃度1500左右.OD值1.90，用thermo的反轉(zhuǎn)錄盒子，先加8.5μLDEPC水，3μLRNA模板，1μL隨機引物，65度5分鐘后，再加入buffer4μL，dNTP 2μL，酶1μL，酶抑制劑0.5μl，42度2小時，70度10分鐘，然后用actin和GAPDH內(nèi)參PCR，Tm值分別為57/59度，但是電泳后啥也沒有，怎么回事兒��？求解～ @biostar2009 @wizardfan 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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半仙0356
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2016-05-24 07:49:52
2樓2016-05-24 06:51:02
jackyoung
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myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-05-26 17:48:03
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-05-26 17:48:03
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首先你得有個引物正確括增出來的正對照，做實驗不放對照都是耍流氓，讓我們沒法猜; 看你的體系，RNA如果是NanoDrop測定的話，1500左右的單位是什么？ug / ml或等價的ng/ul ?還是其它？如果是的話，你的RNA用量有點兒高。還有對于隨機引物的描述不理解，如果是隨機引物我們的反轉(zhuǎn)錄條件不是這樣，是不是混合引物（6-mer隨機引物+Oligo dT）?65℃后冰上的chill呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-05-24 06:51:47
mlxmiao
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5樓2016-05-25 07:17:07
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