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半仙0356新蟲 (正式寫手)
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[求助]
反轉(zhuǎn)錄和PCR問題╭(°A°`)╮ 已有2人參與
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自己提的RNA，濃度1500左右.OD值1.90，用thermo的反轉(zhuǎn)錄盒子，先加8.5μLDEPC水，3μLRNA模板，1μL隨機引物，65度5分鐘后，再加入buffer4μL，dNTP 2μL，酶1μL，酶抑制劑0.5μl，42度2小時，70度10分鐘，然后用actin和GAPDH內(nèi)參PCR，Tm值分別為57/59度，但是電泳后啥也沒有，怎么回事兒啊？求解～ @biostar2009 @wizardfan 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2016-05-24 06:51:02
jackyoung
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首先你得有個引物正確括增出來的正對照，做實驗不放對照都是耍流氓，讓我們沒法猜; 看你的體系，RNA如果是NanoDrop測定的話，1500左右的單位是什么？ug / ml或等價的ng/ul ?還是其它？如果是的話，你的RNA用量有點兒高。還有對于隨機引物的描述不理解，如果是隨機引物我們的反轉(zhuǎn)錄條件不是這樣，是不是混合引物（6-mer隨機引物+Oligo dT）?65℃后冰上的chill呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-05-24 06:51:47
半仙0356
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4樓2016-05-24 07:49:52
mlxmiao
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7樓2016-05-26 14:00:34
mlxmiao
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8樓2016-05-26 17:01:33
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9樓2016-05-26 18:46:17
10樓2016-05-26 21:52:44
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