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半仙0356新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
反轉(zhuǎn)錄和PCR問(wèn)題╭(°A°`)╮ 已有2人參與
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自己提的RNA，濃度1500左右.OD值1.90，用thermo的反轉(zhuǎn)錄盒子，先加8.5μLDEPC水，3μLRNA模板，1μL隨機(jī)引物，65度5分鐘后，再加入buffer4μL，dNTP 2μL，酶1μL，酶抑制劑0.5μl，42度2小時(shí)，70度10分鐘，然后用actin和GAPDH內(nèi)參PCR，Tm值分別為57/59度，但是電泳后啥也沒(méi)有，怎么回事兒啊？求解～ @biostar2009 @wizardfan 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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半仙0356
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9樓2016-05-26 18:46:17
2樓2016-05-24 06:51:02
jackyoung
新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-05-26 17:48:03
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-05-26 17:48:03
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首先你得有個(gè)引物正確括增出來(lái)的正對(duì)照，做實(shí)驗(yàn)不放對(duì)照都是耍流氓，讓我們沒(méi)法猜; 看你的體系，RNA如果是NanoDrop測(cè)定的話，1500左右的單位是什么？ug / ml或等價(jià)的ng/ul ?還是其它？如果是的話，你的RNA用量有點(diǎn)兒高。還有對(duì)于隨機(jī)引物的描述不理解，如果是隨機(jī)引物我們的反轉(zhuǎn)錄條件不是這樣，是不是混合引物（6-mer隨機(jī)引物+Oligo dT）?65℃后冰上的chill呢？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
3樓2016-05-24 06:51:47
半仙0356
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不好意思～濃度單位是ng/μl，引物是隨機(jī)六聚體引物～以前這么做都成功了，但是最近兩次都沒(méi)出結(jié)果～謝謝 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
4樓2016-05-24 07:49:52
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