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zouzongsheng新蟲 (小有名氣)
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[求助]
從基因組上pcr 做梯度出現(xiàn)仍然出現(xiàn)多條帶 已有1人參與
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這是從基因組上P 進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)置的梯度 退火溫度從48 到62 左邊10 個(gè)孔是用一對引物P的 目的條帶大小655bp 右邊十個(gè)用的另一對引物 目的條帶大小920bp P的是同一個(gè)基因 用的2000的Maker 請問還是出現(xiàn)這種情況該怎么優(yōu)化呢？ |
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2016-06-01 15:26:41, 45.54 K
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用基因組做模板進(jìn)行pcr，確實(shí)會(huì)出現(xiàn)非常多非特異性條帶，這個(gè)很正常，甚至有時(shí)候無法避免，那么你需要確定的就是，在某個(gè)條件下，你的目的條帶的濃度最高，然后通過切膠回收來進(jìn)行下游的實(shí)驗(yàn)。看了一下你的膠圖，不知道你的循環(huán)數(shù)有多少，當(dāng)然主要是本身引物質(zhì)量不高，這個(gè)可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)需要沒辦法改變，那么退火溫度還可以再高一些，到70度左右都可以的。還有不知道你的模板GC含量如何，需要的話，可以用GC buffer試試。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-06-01 21:47:55
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你可以檢測一下你引物的特異性，通過NCBI網(wǎng)站中的引物blast即可；如果引物特異性很好，那就調(diào)節(jié)一下你的PCR體系，是否是鎂離子濃度太大，鎂離子濃度太大的話，會(huì)造成非特異性擴(kuò)增；引物濃度也不能過高，模板濃度也不能過高；再者就是你的PCR程序問題，退火溫度適當(dāng)調(diào)節(jié)，循環(huán)次數(shù)降低至20或25試試。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-06-02 23:46:04
zouzongsheng
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9樓2016-06-03 23:05:43
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