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zy晨曦新蟲 (小有名氣)
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[求助]
上樣量對(duì)樹(shù)脂純化蛋白的影響 已有2人參與
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| 首次使用弱陰離子交換樹(shù)脂純化蛋白，第一次上柱70%的吸附量后洗脫，低濃度鹽可以洗脫出來(lái)蛋白，第二次上樣量減少到50%左右上柱后洗脫，增加鹽濃度才能洗脫蛋白，這是為何。第一次上樣前樹(shù)脂再生是利用1M氯化鈉，第二次上樣前再生是利用堿-鹽再生。并且有個(gè)問(wèn)題，弱陰離子交換樹(shù)脂的Ph如何調(diào)整到合適的ph，現(xiàn)在我都是倒出來(lái)調(diào)好ph然后裝柱，有個(gè)朋友說(shuō)不用調(diào)整ph。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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你說(shuō)的應(yīng)該是DEAE Sepharose FF 介質(zhì)，什么PH要看你的目標(biāo)酶的穩(wěn)定性，最高活性PH，PI等，要大于你目標(biāo)酶的PI一個(gè)單位至少。層析過(guò)程：平衡，上樣，清洗，洗脫，不存在換PH的說(shuō)法，換也是換平衡緩沖液的PH，直接用新的緩沖液平衡就好，不用倒出來(lái)。 上柱70%還是50%的吸附量你如何確定的。上樣量越多殘留在介質(zhì)緩沖體積重的沒(méi)吸附的蛋白越多，所以低鹽能洗出來(lái)，上樣量小，緩沖體系殘留的蛋白越少，所以要增加鹽濃度洗脫出吸附量弱的蛋白。祝順利。 |
2樓2016-06-07 10:42:21
zy晨曦
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謝謝您的回復(fù)，首先ph問(wèn)題是因?yàn)闃?shù)脂在洗脫過(guò)程中或是放置一天后流出液的ph升高，由原先的7.5上升至8.0，所以再次使用時(shí)我都會(huì)將ph調(diào)到7.5.利用0.025的磷酸鹽緩沖液要沖洗很長(zhǎng)時(shí)間，所以就將樹(shù)脂倒出調(diào)ph。 上樣量是隨意改變的，上樣量是樹(shù)脂最大吸附量的70%和50%，因?yàn)榈谝淮问褂米畲笪搅康?0%上樣，出現(xiàn)了0.05M的氯化鈉洗脫出目的蛋白（以前從沒(méi)有洗脫出來(lái)，估計(jì)和上樣量或是樹(shù)脂使用次數(shù)過(guò)多導(dǎo)致某些目的蛋白吸附力弱有關(guān)），0.2M也能洗脫。所以降低上樣量為最大吸附的50%。但是0.4M的氯化鈉（以前是0.2M氯化鈉）才能洗脫出目的蛋白。這兩次的蛋白純化實(shí)驗(yàn)和以前的都有不同之處。 |
3樓2016-06-11 20:32:06
walking dead
金蟲 (小有名氣)
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4樓2016-06-15 17:12:54
zy晨曦
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5樓2016-06-17 19:30:07
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