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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 化學化工區(qū) » 分析 » 色譜質譜 » 【資源】液相色譜柱原理
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【資源】液相色譜柱原理
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液相色譜柱原理 與液相色譜柱的性能相關的因素很多，基質（matrix）或者說擔體、載體的化學性質、鍵合相（固定液）的化學性質、填料形狀大小粒度分布、碳量和鍵合度等等。 色譜柱填料可以由基質直接構成，如硅膠、氧化鋁、高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或者甲基丙烯酸酯等等；也可以在這些基質的基礎上涂布或化學鍵合固定液來構成，如：最經典的各種ODS柱、氨基柱、氰基柱等。 一、我們先來看看各主要基質的特點： 1、 硅膠 硅膠是陶瓷性質的無機物基質，剛性大，不易變形�；瘜W性質較穩(wěn)定，但對于水溶液尤其堿性水溶液仍然是不穩(wěn)定的，即使表面經過良好的化學鍵合，覆蓋了固定液，還是要注意水、堿性溶液、酸性溶液對硅膠的溶解作用，基質或者說是柱床（packed bed）溶解對色譜柱的影響是致命的。以硅膠為基質的填料構成了目前絕大多數的色譜柱填料。純硅膠填料適宜分離溶于有機溶劑的極性、弱極性的非強離解型的化合物，硅膠也可以做凝膠色譜但柱效較低。硅膠基質鍵合固定相的高壓液相填料，有其他填料無法比擬的高分離效能。 2、 二氧化鋁 二氧化鋁和硅膠相似，但對水溶液、酸性堿性水溶液溶液更加不穩(wěn)定。所以，極少用作鍵合固定相的基質，也是適宜分離溶于有機溶劑的極性、弱極性的非強離解型的化合物，尤其是分離芳香族碳氫化合物。酸性易離解的化合物容易在二氧化鋁上形成死吸附。另外，氧化鋁分離幾何異構體能力優(yōu)于硅膠。 3、 聚合物填料 聚合物基質受壓會變形，壓力限度低但pH使用范圍寬。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強，使用任何流動相，在整個pH范圍內穩(wěn)定，可以用強酸、強堿來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。由于不耐壓、有溶脹性，所以聚合物填料適宜用于大分子像蛋白質或合成的高聚物，另外還可以制成分子排阻、離子交換柱。近年發(fā)展迅速的大孔樹脂，實際上主體就是苯乙烯-二乙烯苯聚合物或類似的合成高聚物。 由于硅膠基質的絕對地位，以下主要以硅膠為例。 二、形狀大小粒度分布 基質要成為填料，首先要制成合適的形狀和大小。硅膠形狀有：薄殼型、無定形全多孔、球形全多孔，另外還有先做成微珠再堆積成球形全多孔的。通常只說不定形、球形。無定形全多孔的填料容易制備、價格低、粒度分布較均勻，但渦流擴散大，滲透性差，比較難填裝出穩(wěn)定的柱床，一般用來做制備柱。球形全多孔填料渦流擴散小，滲透性好；如果是硅膠先做成珠子再堆積而成的話，具有傳質阻抗小、載樣量大的優(yōu)點，柱效也更高。球形填料外形對稱，比較容易填出穩(wěn)定的柱床。填料的大小一般不能直接測量，因為填料粒度有一定分布范圍，一般給出的大小只是用一定方法測得的表觀大小。填料大小與柱效、柱壓的關系為：柱效與填料大小成反比，柱壓與填料大小的二次方成正比。所以，快速分析柱使用3微米粒度的填料、一般做成5厘米長，就是為了降低柱壓；需要注意到降低粒度所得到的柱效增加跟不上柱壓的增加快。 基質做成合適的形狀和大小后，可以通過各種化學修飾（modified）的手段，獲得各種不同選擇性的填料。有時候，我們增加柱長、降低填料粒度都無法把一個化合物分離的更好，這時候就要考慮使用選擇性更好的填料。 三、碳量和鍵合 硅膠主要通過表面的極性硅醇基保留極性分子，屬于正相分離模式。通過硅烷化技術，可以把各種不同性質的功能團（functional group）建合到硅膠表面，例如：鍵合十八烷基（ODS，octadecyl silane）、辛烷基、甲基、苯基增加對非極性物質分子的保留，構成反相色譜；鍵合帶二醇基、氨基、氰基等極性基團的硅烷改善對某些極性分子的保留，構成正相色譜；鍵合有醚基的鍵合相構成中等極性的正相或反相色譜；鍵合強酸性磺酸型或者強堿性季銨鹽型鍵合相，構成離子交換色譜。 對于硅膠反相鍵合相填料，鍵合的烴基，鏈長增加，載樣量增大，k值增大，對非極性物質的保留時間延長。填料含碳量用元素分析來測量。通常，所得結果直接用來表示填料的碳量。在相同的硅膠基質上，相同的鍵合度，配基分子量越大，碳量越大；因此，C18固定相比C1固定相有更高碳量。相同配基，相同硅膠；覆蓋率越高，碳量越大。對于相同配基，相同的表面覆蓋率；填料的碳量隨孔徑的增加而減少，因為比表面積下降了。因此，我們可看到，只用碳量是不能衡量填料的保留性能的，所以要引入鍵合度概念。 鍵合度有時候也叫做表面覆蓋率。鍵合度是鍵合相表面組成的一個非常重要的量，也是決定填料的選擇性的一個重要的參數。 鍵合相是用有機硅烷與硅膠表面進行化學反應而產生的，目的是獲得均勻的單分子層。在鍵合反應中可使用單功能基、雙功能基和三功能基的硅烷，多功能基的硅烷可以獲得更高的鍵合密度。填料的選擇性決定于鍵合的密度。尤其是在分離碳水化合物時，不同鍵合密度表現出不同的選擇性。多數商品鍵合柱屬于單功能基的，單功能基的鍵合覆蓋率更容易預測，因為不會有第二功能基產生復雜的副反應，用單功能基硅膠可以得到高的重現性，但是，硅膠表面鍵合單功能基硅烷比鍵合多功能基的更容易水解。三功能基硅烷在硅膠表面的鍵合，更難重現，折衷一下，鍵合二功能基，使得更耐水解。對于在高或低pH，易于水解的流動相中，最好使用耐用的多功能基鍵合硅膠。所有硅膠基質的離子交換填料都是三功能基的。如果氰基填料用于反相色譜，硅膠基質（低孔體積）的用三功能基硅烷較好。一些生產商會生產專門用于反相色譜的氰基鍵合相。 對于許多反相填料，要進行二次鍵合以覆蓋硅膠表面未被反應的硅醇基。通常使用小分子硅烷，如三甲基氯基硅烷（TMCS），以便獲得最大的覆蓋率。這個步驟稱為封端（end capped）。在反相色譜中，封端用于多數的鍵合相；用在正相或其他色譜的鍵合相一般不用封端。沒有封端的反相色譜填料通常比封端的有復雜多樣的選擇性。但是，堿性物質在不封端的填料上，容易產生拖尾。三甲基硅烷基（封端基團）在酸性條件下容易水解。因此，對于不同的被分析物要按實際情況選擇封端或者不封端的填料，封端的填料也不能在pH<2的條件下使用。 四、色譜分離模式：正相、反相、離子交換、離子抑制、親水作用等。 正相色譜是色譜的經典形式，使用極性固定相和非極性流動相。洗脫物通過其極性基團和固定相上的極性基團作用被保留。這種應用，經典的是使用未鍵合的硅膠和氧化鋁，但現在使用的極性鍵合相有以下優(yōu)點：鍵合相平衡快，對流動相中微量的水不敏感，和產生不同的選擇性。二醇基鍵合相比純硅膠極性小，平衡速度快；氰基鍵合相是保留能力最小的正相吸附劑；氨基鍵合相適宜分離芳香族碳氫化合物 反相色譜已成為最流行的色譜分離模式。反相色譜中，固定相非極性，流動相極性。典型的流動相一般是水或水系緩沖液與甲醇、乙腈或四氫呋喃的混合物。典型的固定相是用脂肪烴硅完化的硅膠鍵合相，其它用于反相色譜的基質有石墨化碳和苯乙烯-二乙烯苯基質。反相色譜的性能還受殘留的硅醇基的活性的影響。硅醇基與洗脫物的極性基團作用。因此，根據硅醇基的活性不同，填料顯示出不同的選擇性。而且，常能觀察到堿性物質在硅醇基活性高的填料上產生拖尾峰。修飾硅醇基活性的一個辦法是封端，即用硅烷化試劑把硅醇基轉變成三甲基甲硅烷基基團。不過，即使是作了封端，基質表面的硅醇基密度還是比鍵合配基的密度大。硅醇基的活性也和硅膠的預處理（基質滅活）、硅膠純度有關。堿性分析物的色譜分析推薦使用高純度硅膠基質、充分封端的鍵合相。未封端的填料在許多應用中有可以獲得不同選擇性的優(yōu)點。 使用帶有離子電荷的固定相，使根據洗脫物電荷進行分離成為可能。對于硅膠基質的離子交換填料，離子基團通過標準的硅烷化技術鍵合到硅膠表面。對于聚合物基質的離子交換填料，離子交換基團分布于交聯聚合物的整體（through the matrix）。有四種離子交換填料：強/弱陽離子交換填料和強/弱離子交換填料。弱離子交換填料的特征是電量與pH值有函數關系。以羧酸基為功能基的離子交換劑是弱陽離子交換劑的代表。弱陰離子交換劑由一級、二級、三級銨為功能基。大部分強離子交換劑的電荷與pH值無關。四級銨形成強陰離子交換劑，而磺酸基構成了強陽離子交換劑。所有這些離子交換基團都可以在聚合物基質上見到，主要用于分離生物大分子。除了弱陽離子基團外，其它功能基都可以鍵合到硅膠上。 離子抑制（離子對）色譜廣泛用于在低pH下分析洗脫液中的有機酸。它只是反相色譜的一個分支。特殊的聚合物固定相適用于這種應用，因為耐酸堿范圍大。親水作用色譜是正相色譜擴展到水系洗脫液。用極性固定相配合水-有機流動相。與反相色譜相反，保留隨有機相的增加而增加。這種應用多用胺丙基鍵合相作固定相。當然，硅膠本身，二醇類或其他極性固定相也可以用。通常應用胺丙基固定相來分離碳水化合物。專門設計用于這種應用的柱子稱為糖柱。 五、填裝 有了好的高效色譜柱填料，還要有辦法把它很好的填裝到優(yōu)質的不銹鋼管才行。裝柱是把填料分散到液體中形成勻漿后，通過特殊的高壓泵泵入鋼管中的。使用的泵通常耐10000PSI以上的壓力。至于不銹鋼管完美幾何形態(tài)的管腔和優(yōu)質的材料也是很重要的。 六、柱子長度和內徑 已經說過，填料粒度小，柱子就要做的短，因為壓力太大顆粒和機器都受不了。3微米的填料一般裝到10厘米就是極限了，5微米可以裝到20厘米。較窄的孔徑，可以增加柱效，它會影響范氏方程中的渦流擴散，但是同時它會增大柱壓、減少載樣量，一般的內徑是2.1毫米到4.6毫米。 |
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