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leiopixie木蟲 (小有名氣)
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[交流]
討論：液相色譜柱選擇 已有16人參與
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近日做一個項目的LC-MS雜質(zhì)解析，在選擇色譜柱過程中發(fā)現(xiàn)一篇關(guān)于色譜柱選擇的文章，寫得很好，貼出來大家一起學(xué)習(xí)交流，也希望蟲友們把自己用得好的色譜柱及其特征和性能貼出來和大家分享~~~ 如何選擇色譜柱，比較一下C-18及C-8柱的硅烷基質(zhì) C-18和C-8硅烷色譜柱是高效液相色譜（HPLC）中最常使用的色譜柱，而且，在美國市場上有多于100種C-18和C-8色譜柱出售。面對這么多可供選擇的色譜柱，分析工作者很難從中選出適當(dāng)?shù)纳V柱來具體使用，同時更難選擇出一根合適的替換柱。 對于非極性樣品（如小分子芳烴）或弱極性樣品（如對羥基苯甲酸酯），C-18和C-8色譜柱是最容易選擇的。對于這類樣品，色譜柱之間的主要差異在于保留因子（k）；而在選擇性方面卻只有微小的差異。但對于極性和中等極性樣品色譜柱的選擇卻相當(dāng)困難。例如含氨基或酸性基團的藥物化合物。分析工作者會發(fā)現(xiàn)極性樣品在保留時間、選擇性和峰形都有很大的差別。 色譜柱的選擇性和峰形受到擔(dān)體硅膠的影響遠大于鍵合相的影響。另外，有研究報道在反相色譜中表面硅烷醇、硅酸及金屬雜質(zhì)的影響。在特殊情況下，選擇性的差異可由填料制備時使用的鍵合過程決定的。 通常情況下，色譜工作者選擇HPLC色譜柱是通過比較由色譜柱供應(yīng)商所提供的填料介質(zhì)的規(guī)格來決定的。這些規(guī)格內(nèi)容包括：表面積、末端封尾、含碳量、顆粒形狀、顆粒尺寸、孔徑、孔容積、裝填密度和鍵合度。含碳量和鍵合度僅由色譜制造商提供，沒有這些規(guī)格使用者不可能計算出碳的克數(shù)，也不可能計算出一根色譜柱中鍵合相的微分子數(shù)。分析工作者可使用這兩個數(shù)據(jù)來估計一根色譜柱的疏水性質(zhì)。然而，即使制造商提供所有上述規(guī)格數(shù)據(jù)，使用者也不可能精確地預(yù)測出色譜柱對含有極性官能團的化合物的選擇性。 由于色譜的保留時間是基于分析物和填充基質(zhì)之間許多微妙的相互作用，我們建議使用混合物測試來比較填充基質(zhì)的規(guī)格與性能。Engelhardt 和他的同伴回顧了硅烷反相色譜的特性，并且提出用溶解物試驗來描述固定相的疏水性和親硅基醇特性。另外有一些人也改進了測試條件和方法來解釋那些色譜數(shù)據(jù)，但他們只測試了很少的商品色譜柱，并且在他們的測試混合物中沒有羧酸。在本文中，我們使用了一個含有羧酸的測試混合物來收集了86根C-18和C-8硅烷色譜柱（見表1）的數(shù)據(jù)。我們將測試結(jié)果詳細(xì)描述如下。表1：研究中所使用的色譜柱的生產(chǎn)商(略)。 在我們的比較中，我們使用了含有6種物質(zhì)的測試混合物，此6種物質(zhì)列于圖1。每一種物質(zhì)在測試混合物中都起特殊的作用。尿嘧啶是用于產(chǎn)生空體積。甲苯是測試色譜柱的疏水性。吡啶和N，N-二甲基苯胺是用來測試硅醇基對堿性物質(zhì)的活性的堿性胺類物質(zhì)。苯酚是一種弱酸，用于與吡啶聯(lián)合起來確定活性擔(dān)體硅的數(shù)量。4-正丁基苯甲酸是一種用于測試硅醇基對酸性物質(zhì)的活性羧酸，此方面是色譜柱制造者開發(fā)堿性去活色譜柱來作胺類物質(zhì)分析時經(jīng)常忽略的。 我們使用的流動相是含有65%的乙腈和35%的濃度為0.05M的磷酸鉀混合溶液，pH值為3.2。pH=3.2的緩沖溶液可使4-正丁基苯甲酸質(zhì)子化，同時可提高吡啶和N，N-二甲基苯胺的保留時間的重現(xiàn)性。我們發(fā)現(xiàn)使用沒有加緩沖溶液的流動相，如65%乙腈和35%水，即使我們使用同一瓶流動相，也無法得到重現(xiàn)性較好的保留時間和峰形。高離子強度的緩沖溶液，如本次測試所使用的0.05M的緩沖溶液，會抑制一些硅醇基的活性（2，5），但對于將胺從一些非堿性去活的反相色譜柱中洗脫下來，有一些抑制作用是必要的。 我們測試過另外兩種緩沖溶液，但它們的作用均少于pH=3.2的0.05M磷酸鉀溶液。0.01M磷酸鉀緩沖溶液在pH=3.2時，胺類化合物在有些色譜柱中產(chǎn)生前移峰。0.05M磷酸鉀緩沖溶液在pH=7時，胺類物質(zhì)產(chǎn)生的峰形比在pH=3.2時更好。吡啶和N，N-二甲基苯胺的pKa均大約為5.2；因此，這些組分在pH=7時未質(zhì)子化并且呈中性，同時并不與強酸性的硅醇基發(fā)生離子交換作用。 |
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