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jinling158銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
實(shí)時(shí)熒光PCR咨詢-不勝感激 已有2人參與
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我最近正研制細(xì)菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，但是碰到了一些問(wèn)題，兩三個(gè)月之前做出的靈敏度還可以，但三個(gè)月之后就靈敏度降低了，Ct值增加了2~3，但是試劑什么的都沒(méi)有變啊。我用的ABI預(yù)混液，難道是酶降解了（一直按照說(shuō)明書(shū)4度保存，但其中有一晚上冰箱壞了第2天上午修好了，這個(gè)應(yīng)該不會(huì)有影響吧）？另外，難道引物探針也降解了？引物探針的純化方式是PAGE，這種純化方式是不是沒(méi)有離子交換HPLC的純度和穩(wěn)定性好��？都是PAGE純化，不同公司合成的探針質(zhì)量是不是不一樣呢？寶生物銷售跟我說(shuō)他們合成的探針質(zhì)量好。又或是我的DNA降解了？對(duì)于低濃度的質(zhì)粒DNA，有沒(méi)有好的保存方法��？比如說(shuō)用低吸附的管子，里面要加一些什么樣的保護(hù)劑嗎？負(fù)20度還是負(fù)80度保存呢？ 謝謝各位！對(duì)您的答復(fù)不勝感激！ |
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西門(mén)吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-08-05 22:47:26
西門(mén)吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-08-05 22:47:26
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我也一直在做Ct相關(guān)的qPCR,有幾種原因可能導(dǎo)致Ct靠后： 1.探針最好是HPLC純化方式，PAGE對(duì)探針來(lái)說(shuō)純化不夠，引物PAGE純化OK，不同廠商合成的有差異，TAKARA算不錯(cuò)的。 2.引物探針用TE溶解，并分裝，減少反復(fù)凍融，探針?lè)盅b于棕色不透明管防止熒光標(biāo)記降解。 3.模板降解：盡量用高濃度質(zhì)粒保存于-20度，少凍融，用于做靈敏度的質(zhì)粒濃度肯定很低，易降解，最好每次都用高濃度來(lái)現(xiàn)配現(xiàn)用。 希望對(duì)你有用。 |
4樓2016-08-05 17:15:15
2樓2016-07-22 14:08:08
3樓2016-08-01 09:53:30
足下客
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 39 (小學(xué)生)
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- 專業(yè): 臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-11-14 07:41:25
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-11-14 07:41:25
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靈敏度降低時(shí)很正常的，我們公司研發(fā)生產(chǎn)的試劑盒有些也會(huì)出現(xiàn)這種情況，產(chǎn)品正式輸出以前，都會(huì)做穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的，反復(fù)凍融，實(shí)時(shí)穩(wěn)定性，開(kāi)瓶穩(wěn)定性等。我們說(shuō)明書(shū)上會(huì) 要求反復(fù)凍融不能超過(guò)三次，但是實(shí)際上有的凍融2次不光Ct值延后，而且熒光增峰也會(huì)下降。 我想問(wèn)一下你的ABI預(yù)混液是放到哪里保存的？酶是單獨(dú)添加的嗎？ 我們調(diào)試試劑用的buffer和酶等原料都是自己配置的。 熒光PCR檢測(cè)試劑盒最重要的兩部分，一是探針引物的設(shè)計(jì)合成。二是酶反應(yīng)體系。你可以一項(xiàng)項(xiàng)的排除一下 |
5樓2016-08-08 10:12:49
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