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1393075615木蟲 (知名作家)
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[交流]
蛋白表達純化 已有2人參與
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| 我是一名本科生，跟著老師們在做科研實驗，前期將一個基因連接到PTYB12上（連上以后含有CBD標簽不連空載也有CBD標簽），菌液PCR一切正常，但是測序一直不正確，所以老師直接把序列給公司去做了，回來以后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細胞，做菌液PCR條帶大小正常，然后又酶切小片段也對，但轉(zhuǎn)化進入rp感受態(tài)細胞以后不會長，所以換了表達菌株BL21細胞，長出了細胞，用LB培養(yǎng)，菌液PCR沒問題，但是最后蛋白不表達，誘導條件，以及溫度時間都摸索過，另外掛過柱子以后，空載可以純化出來，但是連過基因的什么都沒有，求解各位大神，該如何解決這個蛋白不表達問題。 |
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2樓2016-10-04 20:03:21
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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關(guān)于蛋白不表達的原因可以從多方面分析，你BL21菌株是原核表達，原核表達一般是比較容易做的，幾點蛋白不表達原因分析 1）密碼子優(yōu)化問題，根據(jù)密碼子的簡并性可知換掉堿基序列氨基酸不變，所以根據(jù)自己表達系統(tǒng)（你這是原核）進行密碼子優(yōu)化，不同的表達系統(tǒng)有不同的密碼子偏愛性； 2）mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化，同樣的mRNA結(jié)構(gòu)沒有優(yōu)化會導致蛋白的錯誤折疊，表達的蛋白沒有活性； 3）表達載體選擇噶首臺選擇及表達條件優(yōu)化：這一項設(shè)計的比較多，一般感受態(tài)多做幾個，做個對比，還有的特定蛋白只能使用特定感受態(tài)才能做，條件設(shè)置不同的梯度，有可能你現(xiàn)在表達量低，你看不出來，IPTG濃度，降溫表達都可以嘗試。 具體的其他及相關(guān)解決方案可見文檔：原核表達FAQ問題解決 |
3樓2016-10-27 14:12:43
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