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1393075615木蟲(chóng) (知名作家)
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[交流]
蛋白表達(dá)純化 已有2人參與
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| 我是一名本科生，跟著老師們?cè)谧隹蒲袑?shí)驗(yàn)，前期將一個(gè)基因連接到PTYB12上（連上以后含有CBD標(biāo)簽不連空載也有CBD標(biāo)簽），菌液PCR一切正常，但是測(cè)序一直不正確，所以老師直接把序列給公司去做了，回來(lái)以后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞，做菌液PCR條帶大小正常，然后又酶切小片段也對(duì)，但轉(zhuǎn)化進(jìn)入rp感受態(tài)細(xì)胞以后不會(huì)長(zhǎng)，所以換了表達(dá)菌株BL21細(xì)胞，長(zhǎng)出了細(xì)胞，用LB培養(yǎng)，菌液PCR沒(méi)問(wèn)題，但是最后蛋白不表達(dá)，誘導(dǎo)條件，以及溫度時(shí)間都摸索過(guò)，另外掛過(guò)柱子以后，空載可以純化出來(lái)，但是連過(guò)基因的什么都沒(méi)有，求解各位大神，該如何解決這個(gè)蛋白不表達(dá)問(wèn)題。 |
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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蛋白表達(dá)不是測(cè)序正確就一定出來(lái)的，原核表達(dá)最基本需要有正確的閱讀框，和上游的rd序列，外加強(qiáng)終止子 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
2樓2016-10-04 20:03:21
★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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關(guān)于蛋白不表達(dá)的原因可以從多方面分析，你BL21菌株是原核表達(dá)，原核表達(dá)一般是比較容易做的，幾點(diǎn)蛋白不表達(dá)原因分析 1）密碼子優(yōu)化問(wèn)題，根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性可知換掉堿基序列氨基酸不變，所以根據(jù)自己表達(dá)系統(tǒng)（你這是原核）進(jìn)行密碼子優(yōu)化，不同的表達(dá)系統(tǒng)有不同的密碼子偏愛(ài)性； 2）mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化，同樣的mRNA結(jié)構(gòu)沒(méi)有優(yōu)化會(huì)導(dǎo)致蛋白的錯(cuò)誤折疊，表達(dá)的蛋白沒(méi)有活性； 3）表達(dá)載體選擇噶首臺(tái)選擇及表達(dá)條件優(yōu)化：這一項(xiàng)設(shè)計(jì)的比較多，一般感受態(tài)多做幾個(gè)，做個(gè)對(duì)比，還有的特定蛋白只能使用特定感受態(tài)才能做，條件設(shè)置不同的梯度，有可能你現(xiàn)在表達(dá)量低，你看不出來(lái)，IPTG濃度，降溫表達(dá)都可以嘗試。 具體的其他及相關(guān)解決方案可見(jiàn)文檔：原核表達(dá)FAQ問(wèn)題解決 |
3樓2016-10-27 14:12:43
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