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小毛孩24專家顧問 (職業(yè)作家)
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[求助]
熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)-新手求助 已有2人參與
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請(qǐng)問如何設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物？有什么注意事項(xiàng)？ 是不是在NCBI上找到目的基因的序列，然后粘貼到引物設(shè)計(jì)的軟件里，然后就可以生成了？大致流程是這樣吧？ 是不是一般定量PCR的引物擴(kuò)增的片段就100bp左右？ 如果目的基因比較大，是不是只要找其中一個(gè)外顯子的序列拿去設(shè)計(jì)就可以了？比方說，我想檢測(cè)小鼠TLR4的表達(dá)水平，NCBI里講它有25kbp（不知道有沒有理解對(duì)？），沒有直接顯示核酸序列，我看map里面它是由幾個(gè)片段組成的，就拿其中的NM_021297去設(shè)計(jì)引物，得到一對(duì)擴(kuò)增100bp序列的引物，這樣做對(duì)嗎？ 從來沒有做過qPCR，問題比較多，希望大家不吝賜教，謝謝！ |
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引物的具體設(shè)計(jì)要求： 1.引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,Alignment 軟件 看看結(jié)果。 2. 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（自由能小于58.61KJ/mol）。 3.引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。 4.G+C含量在40%~60%之間，45-55％最佳。 5.堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻。 6.引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 7.引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 8.引物5′端可以修飾。 9.3′端不可修飾，而且要避開AT,GC rich的區(qū)域，避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個(gè)）。 10. 引物3′端要避開密碼子的第3位。 11.引物整體設(shè)計(jì)自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6 軟件進(jìn)行比對(duì)看結(jié)果的情況。 12.做熒光定量產(chǎn)物長度80-150bp最好，最長是300bp. 13.引物設(shè)計(jì)避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。 14.引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于70％或者有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。 15.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴(kuò)增的目的片段長度相似。 16.TM值在58-62度之間。 這是引物設(shè)計(jì)原則，但一般不能全部滿足這些要求，所以對(duì)這些原則要有所取舍 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-10-12 00:38:04
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【答案】應(yīng)助回帖
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探針退火溫度比引物會(huì)高一點(diǎn)，其他的和引物差不多，5端不要是G，引物設(shè)計(jì)基本上可以算作是個(gè)經(jīng)驗(yàn)問題，多設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)就不用糾結(jié)了，說的不對(duì)的地方自動(dòng)跳過啊 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-10-12 09:58:17
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7樓2016-10-18 11:32:48
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你好，想請(qǐng)教下我設(shè)計(jì)了21個(gè)堿基長的引物，blast之后發(fā)現(xiàn)和基因組里別的基因mRNA有13個(gè)堿基的一致，這樣的引物還有可能用嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2016-11-15 00:42:09
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9樓2016-11-15 01:14:42
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