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[求助] 這樣的引物能做熒光定量PCR嗎？已有3人參與

圖為熒光定量引物的驗證。從左到右依次為Marker DL5000、引物1、引物2、內(nèi)參GAPDH。雖說目的條帶跑出來了，但最下方引物二聚體也很明顯，包括內(nèi)參也存在引物二聚體，三對引物PCR反應(yīng)的退火溫度分別為53℃、55℃、57℃，后來又試著把三對的退火溫度統(tǒng)一設(shè)為60℃，依舊出現(xiàn)引物二聚體。這種情況下引物還能用做熒光定量PCR嗎？
引物具體信息如下：（1-F %GC為40%，TM值為53.7；1-R %GC為40%，TM值為53.7）；（2-F %GC為45%，TM值為55.8；2-R %GC為40%，TM值為53.7）；（GAPDH-F %GC為61.1%，TM值為59.6；GAPDH-R %GC為50%，TM值為57.8.）

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1樓 2014-09-14 16:52:49

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wangranjun

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沒有雜帶理論上可以做定量的，再重新設(shè)計一下退火溫度就好了，引物二聚體的出現(xiàn)很大程度是因為退火溫度不合適……住順利！

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他日揚翼九萬里，歷大千世界，定我紅塵心！

2樓2014-09-14 18:31:04

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dxh86412

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最好能夠沒有二聚體，因為二聚體主要影響擴增效率，但是如果沒辦法的話，方便的話做個標準曲線看下擴增效率怎么樣，如果在95-105%之間，那用來做定量肯定沒問題，如果太低或太高，就只能重新設(shè)計了。還有你也可以提高退火溫度試試，一般都要在60左右的~

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3樓2014-09-15 00:24:15

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3樓: Originally posted by dxh86412 at 2014-09-15 00:24:15
最好能夠沒有二聚體，因為二聚體主要影響擴增效率，但是如果沒辦法的話，方便的話做個標準曲線看下擴增效率怎么樣，如果在95-105%之間，那用來做定量肯定沒問題，如果太低或太高，就只能重新設(shè)計了。還有你也可以提 ...

我也提高過退火溫度，60度，但是還是出現(xiàn)了二聚體。頭疼，熒光定量我沒做過，好難啊。

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4樓2014-09-15 08:42:55

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jurkat.1640

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引物二聚體產(chǎn)生本底熒光，減少用量就行。

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5樓2014-09-15 12:39:20

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5樓: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-15 12:39:20
引物二聚體產(chǎn)生本底熒光，減少用量就行。

不是說引物二聚體影響擴增效率嗎，你的意思是減少引物的用量嗎？

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6樓2014-09-15 17:04:48

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SCI我來了！��！

7樓2014-09-15 17:35:04

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6樓: Originally posted by 趙曉楠zxn at 2014-09-15 17:04:48
不是說引物二聚體影響擴增效率嗎，你的意思是減少引物的用量嗎？...

減少引物。引物二聚體其實可以增加PCR的特異性

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8樓2014-09-16 08:52:43

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zhangyunjing

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膠圖上的電泳結(jié)果你是不是采用常規(guī)的Taq酶，如果是的話，建議你采用熒光定量的Mix做個PCR，跑膠看一下，因為大部分的熒光定量的Mix中是使用的熱啟動酶，這很好的減少引物二聚體的生成和非特異性擴增。

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9樓2014-09-17 08:44:51

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9樓: Originally posted by zhangyunjing at 2014-09-17 08:44:51
膠圖上的電泳結(jié)果你是不是采用常規(guī)的Taq酶，如果是的話，建議你采用熒光定量的Mix做個PCR，跑膠看一下，因為大部分的熒光定量的Mix中是使用的熱啟動酶，這很好的減少引物二聚體的生成和非特異性擴增。

是的，我是先用普通PCR的Taq酶擴的。很有幫助，謝謝。

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10樓2014-09-20 18:33:31

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