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ttxs99木蟲 (小有名氣)
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關(guān)于實(shí)時熒光定量引物設(shè)計(jì)
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關(guān)于實(shí)時熒光定量引物設(shè)計(jì)，看有的資料說是要夸內(nèi)含子，那我可不可以直接用CDS呢，或者一個外顯子比較大，我在這個外顯子里擴(kuò)呢？ 另外，假如以上都木有好的結(jié)果，可不可以在該基因的3'非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)呢，如果不行的話，又是什么原因呢？ 跪求各路大俠幫忙釋疑解難？  |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 實(shí)時定量PCR |
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amisking: 金幣+2, 鼓勵發(fā)帖交流問題。 2013-01-21 20:19:30
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| 引物設(shè)計(jì)能跨內(nèi)含子的最好，這樣定量時以cDNA為模板P出的產(chǎn)物與基因組DNA模板P出的片段不同。真核生物成熟的mRNA包括5’cap-5'UTR-CDS-3'UTR-polyA。所以可以直接從CDS做。從一個外顯子設(shè)計(jì)引物也是可以的。當(dāng)然也是可以從非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)。 |
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ttxs992樓2013-01-21 10:12:00
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ttxs99: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 謝謝你的耐心回復(fù)~~~~ 2013-01-22 11:12:43
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做定量的反轉(zhuǎn)錄前RNA樣品都需要進(jìn)行DNase消化的。消化掉基因組DNA這一步是非常重要的。否則即使擴(kuò)增片段不同，DNA模板擴(kuò)增出來的產(chǎn)物也是會生成熒光的，會影響定量結(jié)果。而且DNA模板也會競爭引物。只是，如果擴(kuò)增片段大小不同，熔解曲線中會形成不同的peak，很容易從PCR結(jié)果看出樣品是否存在痕量基因組DNA。所以，如果為了省錢，可以不用在逆轉(zhuǎn)錄時做我前面提到的負(fù)對照。如果沒有夸內(nèi)含子的話，這個負(fù)對照是必需做的。 |
6樓2013-01-22 02:17:33
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