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ttxs99木蟲 (小有名氣)
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關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量引物設(shè)計(jì)
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關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量引物設(shè)計(jì)，看有的資料說(shuō)是要夸內(nèi)含子，那我可不可以直接用CDS呢，或者一個(gè)外顯子比較大，我在這個(gè)外顯子里擴(kuò)呢？ 另外，假如以上都木有好的結(jié)果，可不可以在該基因的3'非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)呢，如果不行的話，又是什么原因呢？ 跪求各路大俠幫忙釋疑解難？  |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 實(shí)時(shí)定量PCR |
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5樓2013-01-21 19:27:33
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問(wèn)題。 2013-01-21 20:19:30
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| 引物設(shè)計(jì)能跨內(nèi)含子的最好，這樣定量時(shí)以cDNA為模板P出的產(chǎn)物與基因組DNA模板P出的片段不同。真核生物成熟的mRNA包括5’cap-5'UTR-CDS-3'UTR-polyA。所以可以直接從CDS做。從一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物也是可以的。當(dāng)然也是可以從非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)。 |
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2樓2013-01-21 10:12:00
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3樓2013-01-21 12:27:46
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【答案】應(yīng)助回帖
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RNA樣品做反轉(zhuǎn)錄前是要用DNase消化掉DNA的，所以反轉(zhuǎn)錄后體系中只有RNA和cDNA。RNA不能被DNA聚合酶擴(kuò)增，擴(kuò)增出來(lái)的就是以cDNA為模板的產(chǎn)物。做反轉(zhuǎn)錄時(shí)需要做一個(gè)負(fù)對(duì)照，就是無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄體系，理論上這個(gè)樣品是不會(huì)有擴(kuò)增的。如果出現(xiàn)擴(kuò)增，說(shuō)明RNA樣品中有殘留基因組DNA。 |
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4樓2013-01-21 15:03:17
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