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weandyouzhy木蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR的引物擴(kuò)增后會(huì)被降解掉嗎？
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一般的DNA復(fù)制完成時(shí)，RNA引物會(huì)被降解掉。那么在pcr擴(kuò)增反應(yīng)中。Taq酶會(huì)不會(huì)將引物鏈剪切掉呢？另外，能不能詳細(xì)的介紹下PCR中所加試劑的量的原因。謝謝了 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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bbwalkman
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)幫助解答問(wèn)題！ 2012-04-07 19:03:00
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應(yīng)該是不會(huì)的，因?yàn)樵谀闩苣z的時(shí)候會(huì)發(fā)現(xiàn)在最頂端還是有引物條帶存在的，而且Taq酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除錯(cuò)配，切平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障礙。 PCR試劑中的量： 1.首先要看你的體系是多少ul，規(guī)劃好引物、模板、dNTP、酶和Buffer的量，其余用水補(bǔ)齊。 2.引物一般是要過(guò)量的，這樣才能保證PCR能夠在設(shè)定的循環(huán)里面跑完，一般濃度是uM。 3.模板一般就是ng級(jí)別的就可以了，主要是能保證前期引物可以與其結(jié)合。 4.dNTP的話一般都是mM級(jí)別的，它的濃度要比較大，保證反應(yīng)順利進(jìn)行。 5.酶的話說(shuō)明書上一般都會(huì)提到，按它的活性和單位來(lái)加就可以了。 6.Buffer要根據(jù)你的總體積，將儲(chǔ)備濃度換算成最終的1X的就可以了。 祝好運(yùn)！ |
3樓2012-04-07 14:56:00
imyting
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【答案】應(yīng)助回帖
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weandyouzhy: 回帖置頂 2012-04-07 20:23:00
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weandyouzhy: 回帖置頂 2012-04-07 20:23:00
| 答案是否定的，Taq酶不具有水解引物的能力，不然的話PCR還如何繼續(xù)，或者是你如何控制Taq酶發(fā)揮作用？PCR條件中有考慮這方面的嗎？此外，在拿PCR產(chǎn)物跑膠時(shí)，有時(shí)能看到明顯的引物二聚體條帶，這也說(shuō)明引物不會(huì)被降解。PCR體系中各組分的量基本是圍繞酶和模板確定的，Buffer是10×的，當(dāng)然加總體積的十分之一了，Mg離子的濃度關(guān)系到Taq酶的活力也是確定的，引物的濃度只要達(dá)到一定程度就好了，過(guò)多會(huì)產(chǎn)生二聚體之類的，過(guò)少影響PCR反應(yīng)啟動(dòng)，模板也是的，多了也不好純化啊，酶的話一般都有推薦量的，一定的體積加上那么多的酶就能滿足要求了。而且酶的說(shuō)明書也沒(méi)有明確說(shuō)其活力如何，只是給出在一定條件下的PCR結(jié)果罷了，只是參考。 |
4樓2012-04-07 15:04:58
zhaohq1209
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10樓2012-04-10 10:31:34
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