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amilie030312

金蟲 (正式寫手)


小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
你在木蟲上隨便搜一下就能出來一堆的,剛開始的時(shí)候看看規(guī)則,再用軟件搞搞,等時(shí)間久了直接就在要用的序列兩端附近找找再用引物計(jì)算器算算就可以了。
2樓2010-10-15 14:00:04
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yixuanwin

鐵桿木蟲 (正式寫手)


小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-15 14:00:04:
你在木蟲上隨便搜一下就能出來一堆的,剛開始的時(shí)候看看規(guī)則,再用軟件搞搞,等時(shí)間久了直接就在要用的序列兩端附近找找再用引物計(jì)算器算算就可以了。

什么叫 引物計(jì)算器?

謝謝
3樓2010-10-15 14:59:42
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amilie030312

金蟲 (正式寫手)


小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
呵呵,你在網(wǎng)上搜索引物計(jì)算器,能出來很多的,固定用一個(gè)就行
4樓2010-10-18 09:14:08
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taigongzaici

新蟲 (小有名氣)

★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3):好全啊,辛苦 2010-10-18 10:29:43
引物設(shè)計(jì)原則
引物長(zhǎng)度
一般為15-30個(gè)核苷酸,在做長(zhǎng)片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物,但最多不超過50個(gè)核苷酸。

堿基分布的均衡性
同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè)
GC含量一般40-60%
GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低,使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性
GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。

引物Tm值
一般要求:55℃-65℃。
計(jì)算:
對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物,Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算
對(duì)于較長(zhǎng)引物,Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù),從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到,這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) – 273.15

引物二級(jí)結(jié)構(gòu)
引物二聚體
盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有有較多堿基互補(bǔ)
發(fā)夾結(jié)構(gòu)
尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。

引物3’端
引物的延伸從3’端開始,因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì),不能進(jìn)行任何修飾,否則不能進(jìn)行有效的延伸,甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗?紤]到密碼子的簡(jiǎn)并性,引物3’端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)。

引物5’端
引物5’端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基,在5’端引入一段非模板依賴性序列。
5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列(酶切位點(diǎn)5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基)。
5’端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基,人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。
5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)(如生物素、地高辛等)。

引物的內(nèi)部穩(wěn)定性
過去認(rèn)為,引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸,故3’端最好為G或C。
現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為,引物的5’端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu),而3’端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu),即3’端盡可能選用A或T,少用G或C。
僅僅3’端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。
如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu),只需3’端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合,就可能引發(fā)延伸,造成假引發(fā)。

引物的保守性與特異性
保守性:通用引物——檢測(cè)同一類病原微生物盡可能多的型別
特異性:避免非特異性擴(kuò)增

擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)
模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu),在選擇引物時(shí),應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。
擴(kuò)增區(qū)域的自由能(△G。)小于58.61kJ/mol
引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃
Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) – 500/length

引物與PCR
引物濃度:一般為0.1-0.5umol/L
引物濃度(uM)=n OD×33/(A×312+C×288+G×328+T×303-61)/VH2O VH2O (單位:L)
退火溫度
最適退火溫度(Ta Opt ) = 0.3 ×(Tm  of primer) + 0.7 × (Tm  of product) – 25
一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。

引物設(shè)計(jì)軟件
Primer Premier 5.0
生物軟件網(wǎng)下載
安裝后,用文本編輯器打開WIN.INI,將vspace=DU改為vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo
primer 3
The Primer Generator
NetPrimer

如何使用Primer Premier 5.0
引物設(shè)計(jì)
一般引物設(shè)計(jì)
5’帶酶切位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)
巢式PCR引物設(shè)計(jì)
多重PCR引物設(shè)計(jì)
探針設(shè)計(jì)
引物評(píng)析

引物同源性分析
用Blastn軟件進(jìn)行同源性比較
盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物
選擇3’端與非目的基因不同源的序列作為引物
選擇兩個(gè)引物3’端與同一非目的基因不同源的序列作為引物
5樓2010-10-18 10:26:56
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chiden

木蟲 (正式寫手)


小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
其實(shí)我想說難道樓主想要手動(dòng)設(shè)計(jì)引物???
這樣的話也麻煩了。
現(xiàn)在大家比較習(xí)慣的就是Primer 5這個(gè)軟件簡(jiǎn)單又好學(xué)
另外功能更加強(qiáng)大的就是NTI,現(xiàn)在更新到11.5,用起來復(fù)雜一點(diǎn)
但是可以做很多事情
即使難過,也要微笑著走下去
6樓2012-04-10 10:34:38
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susie780426

銀蟲 (小有名氣)


小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
引用回帖:
6樓: Originally posted by chiden at 2012-04-10 10:34:38
其實(shí)我想說難道樓主想要手動(dòng)設(shè)計(jì)引物???
這樣的話也麻煩了。
現(xiàn)在大家比較習(xí)慣的就是Primer 5這個(gè)軟件簡(jiǎn)單又好學(xué)
另外功能更加強(qiáng)大的就是NTI,現(xiàn)在更新到11.5,用起來復(fù)雜一點(diǎn)
但是可以做很多事情

樓主,軟件設(shè)計(jì)出來的的時(shí)候也未必是沒有缺點(diǎn)的,所以有時(shí)你還是需要手動(dòng)調(diào)整呀,不知道原理,你怎么調(diào)整?
7樓2013-06-21 16:38:42
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趙阿哲

新蟲 (初入文壇)


小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
引用回帖:
3樓: Originally posted by yixuanwin at 2010-10-15 14:59:42
什么叫 引物計(jì)算器?

謝謝...

差不多就是primer5 oligo,DNAstar之類的計(jì)算器
8樓2015-07-29 20:24:19
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