69国产精华最好的产品,一本到视频在线播放,男人的天堂在线观看中文字幕

引物設(shè)計原則
引物長度
一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應(yīng)使用較長的引物，但最多不超過50個核苷酸。

堿基分布的均衡性
同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個
GC含量一般40-60%
GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性
GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。

引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。
計算：
對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算
對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件最常用的計算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) – 273.15

引物二級結(jié)構(gòu)
引物二聚體
盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補
發(fā)夾結(jié)構(gòu)
尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。

引物3’端
引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗�？紤]到密碼子的簡并性，引物3’端最后一個堿基最好不與密碼子第三個堿基配對。

引物5’端
引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。
5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切位點5’端加上適當數(shù)量的保護堿基）。
5’端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。
5’端標記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。

引物的內(nèi)部穩(wěn)定性
過去認為，引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進行延伸，故3’端最好為G或C。
現(xiàn)在的觀點認為，引物的5’端應(yīng)是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3’端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。
僅僅3’端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。
如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3’端幾個堿基與模板互補結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。

引物的保守性與特異性
保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別
特異性：避免非特異性擴增

擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)
模板DNA的某些區(qū)域具有高度復雜的二級結(jié)構(gòu)，在選擇引物時，應(yīng)使擴增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。
擴增區(qū)域的自由能（△G。）小于58.61kJ/mol
引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃
Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) – 500/length

引物與PCR
引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L
引物濃度(uM)=n OD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2O VH2O (單位：L)
退火溫度
最適退火溫度（Ta Opt ） = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7 × (Tm of product) – 25
一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。

引物設(shè)計軟件
Primer Premier 5.0
生物軟件網(wǎng)下載
安裝后，用文本編輯器打開WIN.INI，將vspace=DU改為vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo
primer 3
The Primer Generator
NetPrimer

如何使用Primer Premier 5.0
引物設(shè)計
一般引物設(shè)計
5’帶酶切位點引物設(shè)計
巢式PCR引物設(shè)計
多重PCR引物設(shè)計
探針設(shè)計
引物評析

引物同源性分析
用Blastn軟件進行同源性比較
盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物
選擇3’端與非目的基因不同源的序列作為引物
選擇兩個引物3’端與同一非目的基因不同源的序列作為引物

贊一下(10人)

回復此樓

5樓2010-10-18 10:26:56

已閱回復此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]	作者	回/看	最后發(fā)表

[考研] 311求調(diào)劑 +9	冬十三 2026-03-15	10/500	2026-03-17 22:53 by lbsjt
[考研] 能源材料化學課題組招收碩士研究生8-10名 +3	脫穎而出 2026-03-16	6/300	2026-03-17 21:19 by z1z2z3879
[考研] 344求調(diào)劑 +4	knight344 2026-03-16	4/200	2026-03-17 17:27 by ruiyingmiao
[考研] 【0856】化學工程（085602）313 分，本科學科評估A類院�；瘜W工程與工藝，誠求調(diào)劑 +7	小劉快快上岸 2026-03-11	8/400	2026-03-17 16:57 by ruiyingmiao
[考研] 267一志愿南京工業(yè)大學0817化工求調(diào)劑 +6	SUICHILD 2026-03-12	6/300	2026-03-17 09:24 by 霧散后相遇lc
[考研] 環(huán)境工程調(diào)劑 +6	大可digkids 2026-03-16	6/300	2026-03-16 17:16 by barlinike
[考研] 304求調(diào)劑 +4	ahbd 2026-03-14	4/200	2026-03-16 16:48 by 我的船我的海
[考研] 一志愿211 0703方向310分求調(diào)劑 +3	努力奮斗112 2026-03-15	3/150	2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 283求調(diào)劑 +10	小樓。 2026-03-12	14/700	2026-03-16 16:08 by 13811244083
[考研] 0703化學調(diào)劑 290分有科研經(jīng)歷，論文在投 +7	膩膩gk 2026-03-14	7/350	2026-03-16 10:12 by houyaoxu
[考研] 070305求調(diào)劑 +3	mlpqaz03 2026-03-14	4/200	2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 085601材料工程315分求調(diào)劑 +3	yang_0104 2026-03-15	3/150	2026-03-15 10:58 by peike
[基金申請] 有必要更換申報口嗎 20+3	fannyamoy 2026-03-11	3/150	2026-03-14 00:52 by zhanghaozhu
[考研] 求材料調(diào)劑 085600英一數(shù)二總分302 前三科235 精通機器學習一志愿哈工大 +4	林yaxin 2026-03-12	4/200	2026-03-13 22:04 by 星空星月
[考研] ［0860］321分求調(diào)劑，ab區(qū)皆可 +4	寶貴熱 2026-03-13	4/200	2026-03-13 22:01 by 星空星月
[考研] （081700）化學工程與技術(shù)-298分求調(diào)劑 +12	11啦啦啦 2026-03-11	35/1750	2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[考研] 材料與化工085600調(diào)劑求老師收留 +9	jiaanl 2026-03-11	9/450	2026-03-13 20:22 by JourneyLucky
[考研] 求調(diào)劑 +7	18880831720 2026-03-11	7/350	2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 307求調(diào)劑 +5	超級伊昂大王 2026-03-12	5/250	2026-03-13 15:56 by 棒棒球手
[考研] 277求調(diào)劑 +4	anchor17 2026-03-12	4/200	2026-03-13 11:15 by 白夜悠長