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飛翔的詩(shī)人銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
根據(jù)已知序列，從相同菌種(菌株編號(hào)不同)中能PCR出目的基因嗎？
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| 本人目前要構(gòu)建一株產(chǎn)D-氨基�；傅墓こ叹瑥腘CBI可以查到該酶的核酸序列，相應(yīng)的產(chǎn)酶菌株是Alcaligenes faecalis DA1，但本實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有該菌株，而能買(mǎi)到的是Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)，它也可以產(chǎn)D-氨基酰化酶，不過(guò)網(wǎng)上沒(méi)查到它的酶核酸序列。如果我按Alcaligenes faecalis DA1的酶核酸序列，設(shè)計(jì)引物，用Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)的基因組DNA作模板，可不可以P出目的基因呢？Alcaligenes faecalis DA1中DA1是文獻(xiàn)作者的編號(hào)。 |
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2樓2011-08-08 17:29:34
jinkui960
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+3): 最近很活躍啊，鼓勵(lì)之 2011-08-08 18:14:14
飛翔的詩(shī)人(金幣+2): 非常詳細(xì)的解答 2011-08-09 16:08:25
dhd997(金幣+3): 最近很活躍啊，鼓勵(lì)之 2011-08-08 18:14:14
飛翔的詩(shī)人(金幣+2): 非常詳細(xì)的解答 2011-08-09 16:08:25
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一般來(lái)說(shuō)同一個(gè)種不同菌株的基因序列應(yīng)該高度保守，按照已報(bào)道序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，除非報(bào)道的序列有問(wèn)題，可以先比對(duì)一下看看D-氨基�；妇幋a基因的相似性，最好同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 |
3樓2011-08-08 17:56:45
飛翔的詩(shī)人
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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| 第二位回答的更詳細(xì)，呵呵，第一次發(fā)，沒(méi)弄明白發(fā)金幣的規(guī)則，看來(lái)我還是得設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物了。按目前查到的酶核酸序列設(shè)計(jì)引物，是將編碼區(qū)全部P出來(lái)，還是只P編碼區(qū)的一部分呢�？次墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn)有好多引物設(shè)計(jì)表達(dá)酶時(shí)，上游引物都是直接從起始密碼ATG開(kāi)始的一段序列，下游引物從終止密碼開(kāi)始的一段序列，也就是把編碼區(qū)都P出來(lái)了，這樣感覺(jué)不怎么用軟件也可以設(shè)計(jì)了引物了，我查到酶序列就只有編碼區(qū)，所以是不是也可以這么做呢？ |
4樓2011-08-09 16:23:34
jinkui960
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你可以先按照已經(jīng)報(bào)道的Alcaligenes faecalis DA1 D-氨基�；妇幋a基因設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能擴(kuò)增出來(lái)就沒(méi)有必要設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的。如果沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)的話(huà)再來(lái)考慮設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。 你要表達(dá)Alcaligenes faecalis DA1D-氨基�；傅脑�(huà)，肯定要先把D-氨基�；妇幋a基因的全序列（包括起始密碼和終止密碼）擴(kuò)增出來(lái)，可以把序列克隆到T-載體中長(zhǎng)期保存，如果要構(gòu)建高產(chǎn)菌株的話(huà)，你同時(shí)要考慮載體上有沒(méi)有合適的啟動(dòng)子，如果沒(méi)有的話(huà)，你可以把把D-氨基酰化酶的啟動(dòng)子序列一起克隆到載體里面進(jìn)行表達(dá)。 祝好運(yùn)！ |
5樓2011-08-09 16:59:18
飛翔的詩(shī)人
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送鮮花一朵
非常感謝，這樣我就放心了，不過(guò)由于查到的Alcaligenes faecalis DA1 D-氨基酰化酶序列只有CDS區(qū)（只有一個(gè)報(bào)道的）， 這樣設(shè)計(jì)引物就沒(méi)得選擇，只能是從ATG開(kāi)始的一段序列，以及終止密碼前的一段序列了（用軟件看這兩段引物得分都很低，可能不好P）。最后還想請(qǐng)教一下如何選擇載體，比如怎么判斷載體上有沒(méi)有合適的啟動(dòng)子，我打算就用實(shí)驗(yàn)室的PET 30a做表達(dá)，下面附上了我查到的目的序列，非常感謝！ FEATURES Location/Qualifiers source 1..1455 /organism="Alcaligenes faecalis" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:511" CDS 1..1455 /EC_number="3.5.1.81" /note="DaaAF" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="D-aminoacylase" /protein_id="AAK15530.1" /db_xref="GI:13194736" /translation="MSQPDATPFDYILSGGTVIDGTNAPGRLADVGVRGDRIAAVGDLSASSARRRIDVAGKVVSPGFIDSHTHDDNYLLKHRDMTPKISQGVTTVVTGNCGISLAPLAHANPPAPLDLLDEGGSFRFARFSDYLEALRAAPPAVNAACMVGHSTLRAAVMPDLRREATADEIQAMQALADDALASGAIGISTGAFYPPAAHASTEEIIEVCRPLITHGGVYTHMRDEGEHIVQALEETFRIGRELDVPVVISHHKVMGKLNFGRSKETLALIEAAMASQDVSLDAYPYVAGSTMLKQDRVLLAGRTLITWCKPYPELSGRDLEEIAAERGKSKYDVVPELQPAGAIYFMMDEPDVQRILAFGPTMIGSDGLPHDERPHPRLWGTFPRVLGHYSRDLGLFPLETAVWKMTGLTAAKFGLAERGQVQPGYYADLVVFDPATVADSATFEHPTERAAGIHSVYVNGAAVWEDQSFTGQHAGRVLNRAGA" ORIGIN 1 atgtcccagc ccgacgccac cccgttcgac tacatacttt ccggcggcac cgtcatcgac 61 ggcacgaacg cgccaggccg gctcgccgac gtgggcgtgc ggggcgatcg gattgccgcc 121 gtcggcgacc tgagcgccag cagcgcccgc cggcgcatcg acgtggcggg aaaagtggtg 181 tctccgggct tcatcgactc gcacacgcat gacgacaact acctgctgaa acaccgcgac 241 atgacgccca agatctcgca gggcgtcacc accgtggtca cgggcaactg cggtatcagt 301 ctcgccccgc tggcgcacgc caatccgccc gcgccgctgg atctgctgga cgaaggcggc 361 tcgttccgct ttgcacgctt ctcggactac ctcgaagccc tgcgcgccgc gccgcctgcc 421 gtcaacgccg cctgcatggt gggccattcc accctgcgcg ccgccgtcat gcccgacttg 481 cggcgcgaag ccacggccga tgaaatccag gccatgcagg cgctggccga cgatgcgctg 541 gccagtggcg ccatcggcat ttccacaggc gccttctatc cgcccgccgc ccatgccagc 601 accgaggaaa tcatcgaagt ctgccgcccc ctgatcacgc atggcggcgt ctacgccacc 661 catatgcgcg atgagggcga acatatcgtc caggcgctgg aggagacctt ccgcatcggc 721 cgcgaactgg acgtgccggt cgttatctcg caccacaagg tcatgggcaa gctcaatttc 781 gggcgctcca aggaaacgct ggccttgatc gaggcggcca tggccagcca ggacgtatcg 841 ctggacgcct atccctacgt ggcgggctcc accatgctca agcaggaccg cgtcctgctt 901 gccggccgca cgcttatcac ctggtgcaag ccctatcccg aactgagcgg acgcgacctg 961 gaagaaatcg ccgccgagcg aggcaagtcc aagtacgacg tggtgcccga actgcagccc 1021 gccggcgcca tctacttcat gatggacgag cccgacgtgc agcgcatcct ggcgttcggc 1081 cccaccatga tcgggtccga tggcctgccc cacgacgagc gcccccaccc tcgcctgtgg 1141 ggaacgtttc cccgggtgct gggccactac tcgcgcgacc tgggcctgtt cccattggag 1201 accgcggtct ggaaaatgac cggcctgacc gccgccaaat tcggcctggc cgaacggggc 1261 caggtgcagc ccggctacta cgccgacctg gtggtcttcg acccggccac ggtggcggac 1321 tcggccacgt tcgagcatcc caccgagcgc gccgcgggca tccattcggt ctacgtcaac 1381 ggcgcggccg tctgggaaga ccagtcgttc actggccagc atgccggccg cgtcctcaac 1441 cgggccggag cctga |
6樓2011-08-10 15:41:40
ganchao1776
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7樓2014-11-11 13:58:41
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