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1.5kb的 PCR目的序列GC含量高達67%，引物Tm值達90℃，怎么P比較好？
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本人根據(jù)目的序列的CDS區(qū)設計出引物，由于目的序列本身GC含量達67%，設計出的引物GC含量也超過了60%，oligo給出的兩條引物的Tm值均在90℃左右，其推薦的退火溫度為68.4℃（最高72度）， 上游 5'-tcGAATTCatgtcccagc ccgacgccac cccgtt-3' (EcoR I酶切位點) 下游 5'-tctAAGCTTtcaggctccg gcccggttga ggacg-3'（Hind III酶切位點） oligo最后給引物的PCR評價沒問題，不過這么高的GC含量，該怎么P比較好？如果是用帶GC緩沖液的Taq酶，梯度PCR反應條件該如何設計？ |
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 核酸生物學實驗經(jīng)驗 | 【分子生物】EPI帖 |
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3樓2011-08-29 14:56:14
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4樓2011-08-29 14:58:08
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 很好很強大！我都沒有發(fā)揮的機會了…… 2011-08-29 17:51:41
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 很好很強大！我都沒有發(fā)揮的機會了…… 2011-08-29 17:51:41
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1.因為限制性內(nèi)切酶要發(fā)生酶切的前提是先結合在酶切位點上，不同的限制性內(nèi)切酶結合的堿基數(shù)不一樣，最少的是在識別位點的兩端要多出一個堿基，有的要多出好幾個；再加上PCR得到的片段兩端很容易丟失堿基，所以，對于一般的限制性內(nèi)切酶來說添加4-6個保護堿基是比較保險的，否則可能會導致無法發(fā)生酶切 2.DMSO可以使雙鏈在稍低的溫度下（相比較不加DMSO而言）發(fā)生解離。 3.是指退火溫度 |
6樓2011-08-29 15:37:03
7樓2011-08-29 16:03:33
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9樓2011-08-29 16:47:15
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10樓2011-08-29 17:51:13
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