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飛翔的詩人銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
1.5kb的 PCR目的序列GC含量高達67%，引物Tm值達90℃，怎么P比較好？
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本人根據(jù)目的序列的CDS區(qū)設(shè)計出引物，由于目的序列本身GC含量達67%，設(shè)計出的引物GC含量也超過了60%，oligo給出的兩條引物的Tm值均在90℃左右，其推薦的退火溫度為68.4℃（最高72度）， 上游 5'-tcGAATTCatgtcccagc ccgacgccac cccgtt-3' (EcoR I酶切位點) 下游 5'-tctAAGCTTtcaggctccg gcccggttga ggacg-3'（Hind III酶切位點） oligo最后給引物的PCR評價沒問題，不過這么高的GC含量，該怎么P比較好？如果是用帶GC緩沖液的Taq酶，梯度PCR反應(yīng)條件該如何設(shè)計？ |
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