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飛翔的詩(shī)人銀蟲 (小有名氣)
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1.5kb的 PCR目的序列GC含量高達(dá)67%，引物Tm值達(dá)90℃，怎么P比較好？
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本人根據(jù)目的序列的CDS區(qū)設(shè)計(jì)出引物，由于目的序列本身GC含量達(dá)67%，設(shè)計(jì)出的引物GC含量也超過了60%，oligo給出的兩條引物的Tm值均在90℃左右，其推薦的退火溫度為68.4℃（最高72度）， 上游 5'-tcGAATTCatgtcccagc ccgacgccac cccgtt-3' (EcoR I酶切位點(diǎn)) 下游 5'-tctAAGCTTtcaggctccg gcccggttga ggacg-3'（Hind III酶切位點(diǎn)） oligo最后給引物的PCR評(píng)價(jià)沒問題，不過這么高的GC含量，該怎么P比較好？如果是用帶GC緩沖液的Taq酶，梯度PCR反應(yīng)條件該如何設(shè)計(jì)？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 很好很強(qiáng)大！我都沒有發(fā)揮的機(jī)會(huì)了…… 2011-08-29 17:51:41
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): 很好很強(qiáng)大！我都沒有發(fā)揮的機(jī)會(huì)了…… 2011-08-29 17:51:41
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1.因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶要發(fā)生酶切的前提是先結(jié)合在酶切位點(diǎn)上，不同的限制性內(nèi)切酶結(jié)合的堿基數(shù)不一樣，最少的是在識(shí)別位點(diǎn)的兩端要多出一個(gè)堿基，有的要多出好幾個(gè)；再加上PCR得到的片段兩端很容易丟失堿基，所以，對(duì)于一般的限制性內(nèi)切酶來說添加4-6個(gè)保護(hù)堿基是比較保險(xiǎn)的，否則可能會(huì)導(dǎo)致無法發(fā)生酶切 2.DMSO可以使雙鏈在稍低的溫度下（相比較不加DMSO而言）發(fā)生解離。 3.是指退火溫度 |
6樓2011-08-29 15:37:03
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7樓2011-08-29 16:03:33
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8樓2011-08-29 16:11:10
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西瓜(金幣+3): Good！ 2011-08-29 17:52:10
西瓜(金幣+3): Good！ 2011-08-29 17:52:10
| 就我做過的梯度PCR而言，其反應(yīng)體系和一般PCR體系是一樣的，只是在P的時(shí)候放在梯度PCR儀中進(jìn)行而已，從左至右12個(gè)孔又12個(gè)不同的溫度，其中第一孔與最后一孔分別是你梯度范圍的最低、最高溫度（梯度范圍需在在PCR儀上設(shè)好）。此外，針對(duì)GC含量高的問題，我選的是可擴(kuò)展高GC含量的Taq 及GC buffer，DMSO沒有親自用過，據(jù)說添加體系有些繁瑣。還有引物設(shè)計(jì)軟件顯示的Tm值不一定就是實(shí)際擴(kuò)增時(shí)的Tm值�？傊鱿绿荻葢�(yīng)該有所收獲。 |
9樓2011-08-29 16:47:15
西瓜
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10樓2011-08-29 17:51:13
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