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飛翔的詩(shī)人銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
1.5kb的 PCR目的序列GC含量高達(dá)67%，引物Tm值達(dá)90℃，怎么P比較好？
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本人根據(jù)目的序列的CDS區(qū)設(shè)計(jì)出引物，由于目的序列本身GC含量達(dá)67%，設(shè)計(jì)出的引物GC含量也超過(guò)了60%，oligo給出的兩條引物的Tm值均在90℃左右，其推薦的退火溫度為68.4℃（最高72度）， 上游 5'-tcGAATTCatgtcccagc ccgacgccac cccgtt-3' (EcoR I酶切位點(diǎn)) 下游 5'-tctAAGCTTtcaggctccg gcccggttga ggacg-3'（Hind III酶切位點(diǎn)） oligo最后給引物的PCR評(píng)價(jià)沒(méi)問(wèn)題，不過(guò)這么高的GC含量，該怎么P比較好？如果是用帶GC緩沖液的Taq酶，梯度PCR反應(yīng)條件該如何設(shè)計(jì)？ |
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peace12039088
銀蟲 (小有名氣)
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西瓜(金幣+3): Good！ 2011-08-29 17:52:10
西瓜(金幣+3): Good！ 2011-08-29 17:52:10
| 就我做過(guò)的梯度PCR而言，其反應(yīng)體系和一般PCR體系是一樣的，只是在P的時(shí)候放在梯度PCR儀中進(jìn)行而已，從左至右12個(gè)孔又12個(gè)不同的溫度，其中第一孔與最后一孔分別是你梯度范圍的最低、最高溫度（梯度范圍需在在PCR儀上設(shè)好）。此外，針對(duì)GC含量高的問(wèn)題，我選的是可擴(kuò)展高GC含量的Taq 及GC buffer，DMSO沒(méi)有親自用過(guò)，據(jù)說(shuō)添加體系有些繁瑣。還有引物設(shè)計(jì)軟件顯示的Tm值不一定就是實(shí)際擴(kuò)增時(shí)的Tm值�？傊鱿绿荻葢�(yīng)該有所收獲。 |
9樓2011-08-29 16:47:15
空谷幽風(fēng)
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【答案】應(yīng)助回帖
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飛翔的詩(shī)人(金幣+10): 5 2011-08-29 14:49:28
西瓜(金幣+3): Good 2011-08-29 17:50:35
飛翔的詩(shī)人(金幣+10): 5 2011-08-29 14:49:28
西瓜(金幣+3): Good 2011-08-29 17:50:35
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1.建議你把保護(hù)堿基的數(shù)量增加到4-5個(gè) 2.你說(shuō)的GC緩沖液我沒(méi)用過(guò)，不過(guò)你可以在擴(kuò)增體系中加入DMSO，擴(kuò)增程序可以這么設(shè)置看看行不行： 96℃ 5min 96℃ 30s 63℃ 20s 72℃ 2min 設(shè)置30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.2 |
2樓2011-08-29 13:19:19
飛翔的詩(shī)人
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3樓2011-08-29 14:56:14
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4樓2011-08-29 14:58:08
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