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飛翔的詩(shī)人銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
根據(jù)已知序列，從相同菌種(菌株編號(hào)不同)中能PCR出目的基因嗎？
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| 本人目前要構(gòu)建一株產(chǎn)D-氨基�；傅墓こ叹�，從NCBI可以查到該酶的核酸序列，相應(yīng)的產(chǎn)酶菌株是Alcaligenes faecalis DA1，但本實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有該菌株，而能買到的是Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)，它也可以產(chǎn)D-氨基�；福贿^(guò)網(wǎng)上沒(méi)查到它的酶核酸序列。如果我按Alcaligenes faecalis DA1的酶核酸序列，設(shè)計(jì)引物，用Alcaligenes faecalis(ATCC 8750)的基因組DNA作模板，可不可以P出目的基因呢？Alcaligenes faecalis DA1中DA1是文獻(xiàn)作者的編號(hào)。 |
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飛翔的詩(shī)人
銀蟲 (小有名氣)
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| 第二位回答的更詳細(xì)，呵呵，第一次發(fā)，沒(méi)弄明白發(fā)金幣的規(guī)則，看來(lái)我還是得設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物了。按目前查到的酶核酸序列設(shè)計(jì)引物，是將編碼區(qū)全部P出來(lái)，還是只P編碼區(qū)的一部分呢。看文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有好多引物設(shè)計(jì)表達(dá)酶時(shí)，上游引物都是直接從起始密碼ATG開(kāi)始的一段序列，下游引物從終止密碼開(kāi)始的一段序列，也就是把編碼區(qū)都P出來(lái)了，這樣感覺(jué)不怎么用軟件也可以設(shè)計(jì)了引物了，我查到酶序列就只有編碼區(qū)，所以是不是也可以這么做呢？ |
4樓2011-08-09 16:23:34
2樓2011-08-08 17:29:34
jinkui960
至尊木蟲 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+3): 最近很活躍啊，鼓勵(lì)之 2011-08-08 18:14:14
飛翔的詩(shī)人(金幣+2): 非常詳細(xì)的解答 2011-08-09 16:08:25
dhd997(金幣+3): 最近很活躍啊，鼓勵(lì)之 2011-08-08 18:14:14
飛翔的詩(shī)人(金幣+2): 非常詳細(xì)的解答 2011-08-09 16:08:25
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一般來(lái)說(shuō)同一個(gè)種不同菌株的基因序列應(yīng)該高度保守，按照已報(bào)道序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題，除非報(bào)道的序列有問(wèn)題，可以先比對(duì)一下看看D-氨基�；妇幋a基因的相似性，最好同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 |
3樓2011-08-08 17:56:45
jinkui960
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你可以先按照已經(jīng)報(bào)道的Alcaligenes faecalis DA1 D-氨基�；妇幋a基因設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能擴(kuò)增出來(lái)就沒(méi)有必要設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的。如果沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)的話再來(lái)考慮設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。 你要表達(dá)Alcaligenes faecalis DA1D-氨基�；傅脑挘隙ㄒ劝袲-氨基�；妇幋a基因的全序列（包括起始密碼和終止密碼）擴(kuò)增出來(lái)，可以把序列克隆到T-載體中長(zhǎng)期保存，如果要構(gòu)建高產(chǎn)菌株的話，你同時(shí)要考慮載體上有沒(méi)有合適的啟動(dòng)子，如果沒(méi)有的話，你可以把把D-氨基�；傅膯�(dòng)子序列一起克隆到載體里面進(jìn)行表達(dá)。 祝好運(yùn)！ |
5樓2011-08-09 16:59:18
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