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這樣的引物能做熒光定量PCR嗎？ 已有3人參與
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圖為熒光定量引物的驗(yàn)證。從左到右依次為Marker DL5000、引物1、引物2、內(nèi)參GAPDH。雖說(shuō)目的條帶跑出來(lái)了，但最下方引物二聚體也很明顯，包括內(nèi)參也存在引物二聚體，三對(duì)引物PCR反應(yīng)的退火溫度分別為53℃、55℃、57℃，后來(lái)又試著把三對(duì)的退火溫度統(tǒng)一設(shè)為60℃，依舊出現(xiàn)引物二聚體。這種情況下引物還能用做熒光定量PCR嗎？ 引物具體信息如下：（1-F %GC為40%，TM值為53.7；1-R %GC為40%，TM值為53.7）；（2-F %GC為45%，TM值為55.8；2-R %GC為40%，TM值為53.7）；（GAPDH-F %GC為61.1%，TM值為59.6；GAPDH-R %GC為50%，TM值為57.8.） 20140912.jpg |
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jurkat.1640
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wangranjun
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
趙曉楠zxn: 金幣+5, ★有幫助 2014-09-15 08:40:43
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趙曉楠zxn: 金幣+5, ★有幫助 2014-09-15 08:40:43
| 最好能夠沒(méi)有二聚體，因?yàn)槎垠w主要影響擴(kuò)增效率，但是如果沒(méi)辦法的話(huà)，方便的話(huà)做個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)看下擴(kuò)增效率怎么樣，如果在95-105%之間，那用來(lái)做定量肯定沒(méi)問(wèn)題，如果太低或太高，就只能重新設(shè)計(jì)了。還有你也可以提高退火溫度試試，一般都要在60左右的~ |
3樓2014-09-15 00:24:15
4樓2014-09-15 08:42:55
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