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初學(xué)者對(duì)于蛋白純化的幾點(diǎn)體會(huì) 已有3人參與
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近來(lái)剛接觸蛋白純化的實(shí)驗(yàn)，對(duì)于研究本來(lái)就不多的我來(lái)說(shuō)，這樣的實(shí)驗(yàn)算是一頭霧水。在不斷求知，不斷實(shí)驗(yàn)，不斷看書(shū)的過(guò)程中，現(xiàn)在有幾點(diǎn)體會(huì)，求大神們來(lái)圍觀指點(diǎn)。 先說(shuō)明一下我現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)，是一個(gè)有活性的酶，孢內(nèi)酶，等電點(diǎn)4~5左右，所以使用弱堿性的陰離子樹(shù)脂進(jìn)行純化。 對(duì)于大體方向的實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)驗(yàn)書(shū)籍中都有介紹，無(wú)非是確定樹(shù)脂的類型，確定洗脫劑以及緩沖溶液的pH。這樣再進(jìn)行洗脫劑濃度的測(cè)定。 但是在細(xì)節(jié)方面，我感覺(jué)有更多的疑問(wèn)，致使像我這樣的初學(xué)者不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，更為重要的是在遇到困難時(shí)如何取解決問(wèn)題，這是最為重要的。 好了，現(xiàn)在就開(kāi)始進(jìn)行我的體會(huì)之旅吧。 1、對(duì)于弱堿性陰離子樹(shù)脂，在使用中需要首先活化，一般就是堿-鹽-緩沖液。 這里有就問(wèn)題出現(xiàn)了，為了把樹(shù)脂的ph調(diào)到規(guī)定的ph需要進(jìn)行大量的緩沖液進(jìn)行沖洗，一般是利用高濃度的緩沖液調(diào)整ph后進(jìn)行沖洗，我現(xiàn)在使用的是PBS，害怕磷酸根離子結(jié)合到柱子上的多，所以我沒(méi)有這么做，我是將樹(shù)脂放置瓶中，利用鹽酸調(diào)ph，這樣快，但是步驟繁瑣，樹(shù)脂也有損失。下次想著利用高濃度的pBs試試，畢竟是更簡(jiǎn)便的方法。 2、上柱 蛋白在室溫下容易染菌，尤其是利用細(xì)菌產(chǎn)的酶，這里就需要利用低溫進(jìn)行，但是很多公司并沒(méi)有很多條件，那就放冰塊在盆子里，放樣品，進(jìn)行原始性上樣。 3.上樣量 一般是10%·30%，洗脫規(guī)律比較明顯，書(shū)本上引用的。 4、洗脫 我現(xiàn)在遇到的問(wèn)題是回收率低，提高洗脫濃度，酶活就低了，就是雜蛋白也洗出來(lái)了，這樣，我想 利用降低ph進(jìn)行優(yōu)化，具體的效果如何看下次的實(shí)驗(yàn)了。不過(guò)不報(bào)希望。因?yàn)榻档蚿h，目標(biāo)蛋白和雜蛋白的結(jié)合力都小了，容易洗脫。如果能知道主要的雜蛋白的等電點(diǎn)就好了，但是復(fù)雜的細(xì)胞，里面的酶太多，不容易找，現(xiàn)有的條件液不知道如何去鑒定。 |
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3樓2016-12-19 16:49:47
2樓2016-12-19 16:49:11
13420180917
禁蟲(chóng) (小有名氣)
★
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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4樓2017-12-06 17:13:24
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5樓2018-08-11 21:59:08
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