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初學(xué)者對于蛋白純化的幾點體會 已有3人參與
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近來剛接觸蛋白純化的實驗，對于研究本來就不多的我來說，這樣的實驗算是一頭霧水。在不斷求知，不斷實驗，不斷看書的過程中，現(xiàn)在有幾點體會，求大神們來圍觀指點。 先說明一下我現(xiàn)在的實驗，是一個有活性的酶，孢內(nèi)酶，等電點4~5左右，所以使用弱堿性的陰離子樹脂進行純化。 對于大體方向的實驗步驟，實驗書籍中都有介紹，無非是確定樹脂的類型，確定洗脫劑以及緩沖溶液的pH。這樣再進行洗脫劑濃度的測定。 但是在細節(jié)方面，我感覺有更多的疑問，致使像我這樣的初學(xué)者不能進行實驗，更為重要的是在遇到困難時如何取解決問題，這是最為重要的。 好了，現(xiàn)在就開始進行我的體會之旅吧。 1、對于弱堿性陰離子樹脂，在使用中需要首先活化，一般就是堿-鹽-緩沖液。 這里有就問題出現(xiàn)了，為了把樹脂的ph調(diào)到規(guī)定的ph需要進行大量的緩沖液進行沖洗，一般是利用高濃度的緩沖液調(diào)整ph后進行沖洗，我現(xiàn)在使用的是PBS，害怕磷酸根離子結(jié)合到柱子上的多，所以我沒有這么做，我是將樹脂放置瓶中，利用鹽酸調(diào)ph，這樣快，但是步驟繁瑣，樹脂也有損失。下次想著利用高濃度的pBs試試，畢竟是更簡便的方法。 2、上柱 蛋白在室溫下容易染菌，尤其是利用細菌產(chǎn)的酶，這里就需要利用低溫進行，但是很多公司并沒有很多條件，那就放冰塊在盆子里，放樣品，進行原始性上樣。 3.上樣量 一般是10%·30%，洗脫規(guī)律比較明顯，書本上引用的。 4、洗脫 我現(xiàn)在遇到的問題是回收率低，提高洗脫濃度，酶活就低了，就是雜蛋白也洗出來了，這樣，我想 利用降低ph進行優(yōu)化，具體的效果如何看下次的實驗了。不過不報希望。因為降低ph，目標蛋白和雜蛋白的結(jié)合力都小了，容易洗脫。如果能知道主要的雜蛋白的等電點就好了，但是復(fù)雜的細胞，里面的酶太多，不容易找，現(xiàn)有的條件液不知道如何去鑒定。 |
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13420180917
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5樓2018-08-11 21:59:08
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