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質(zhì)粒DNA的提取與純化 已有2人參與
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一、實驗?zāi)康呐c原理 質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學(xué)實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。 提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步： ①細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增 ②細菌菌體的裂解 ③質(zhì)粒DNA的純化 本實驗采取的菌體裂解方法為堿解法，質(zhì)粒純化方法為梯度離心法。 二、材料與試劑 1、材料：大腸桿菌 2、儀器：超凈工作臺，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀 3、試劑： Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4) 10 mM EDTA(pH8.0) 50 mM葡萄糖 高壓滅菌，4℃保存 Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用 Solution III 5 N KAc pH4.8 高壓滅菌，4℃保存 酚/氯仿 3 M NaAc PH5.2, 高壓滅菌，4℃保存。一、實驗?zāi)康呐c原理，溶菌酶（8 mg/ml）,異丙醇，酚/氯仿，無水乙醇，70％乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑 三、操作步驟 1、細菌繁殖 LB培養(yǎng)基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，搖一搖，過夜 2、離心10 min，5000 rpm, 4℃；棄上淸液 3、沉淀（菌體細胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5000 rpm, 4℃ 加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min 4、重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min 5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min 6、加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12000 rpm, 4℃ 7、加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min 8、離心10 min，12000 rpm, 4℃ 9、取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中 10、加入40 ul，3 M NaAc 11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀 12、離心10 min，12000 rpm, 4℃ 13、取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。 14、電泳檢測提取DNA的質(zhì)量 四、結(jié)果與分析 超螺旋結(jié)構(gòu)DNA |
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