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houchenxi金蟲 (初入文壇)
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[求助]
pcr電泳條帶彌散
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想要p出一個4kb的目的基因，一直p不出來，請大神幫幫忙 我用的cDNA是從RPE細(xì)胞內(nèi)提取出來的，用的聚合酶是方塔高保真酶 體系如下（單位：微升）： 滅菌miniQ：2.8 模板cDNA：2 5*enhancer：2 5*SFbuffer：2 引物1: 0.4 引物2： 0.4 dNTPmix：0.2 方塔高保真酶：0.2 其中引物都稀釋到10vm， 溫度設(shè)置： 預(yù)變性 95度 2min 變性 95度 10s 退火 50~69 都試過 20s 延伸 72度 2min 徹底延伸 72度 10min 中間三個步驟30個cycle 跑膠結(jié)果是彌散的（圖一）： 為了證明我的體系是沒錯的，我用師兄的引物，其他都用我自己的做了一次，發(fā)現(xiàn)是能夠p出來的（圖二） 之后為了證明引物沒有降解，我使用瓊脂糖凝膠電泳（1%，加4微升EB），引物：10*loading buffer：dd水=2:1:7.跑了10分鐘，marker右邊兩個是現(xiàn)在在用的引物（圖三）。 引物已經(jīng)重新設(shè)計過一遍了，連接片段和文獻(xiàn)上的相同， 其實剛開始還是有非特異性條帶的（圖四），現(xiàn)在連非特異性的都沒了，實在不知道為什么  請大神們指教 圖一.jpg 圖二.jpg 圖三.jpg 圖四.jpg |
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houchenxi
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2樓2017-03-30 23:26:37
houchenxi
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