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勝哥的歌新蟲 (初入文壇)
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[求助]
在構(gòu)建RNA干擾載體中，目的片段與PLKO.1的連接問題 已有1人參與
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新人求教 1、在合成我的干擾片段后（上海生工合成），發(fā)現(xiàn)目的片段的5`端是沒有磷酸化的，而是羥基。因?yàn)樵贒NA連接時(shí)要形成3`-5`磷酸二酯鍵，這樣目的片段和我的載體不是沒有辦法連接了？看了所有教程，都沒有談到5`端需要磷酸化，是不是默認(rèn)合成的5端都沒有磷酸化？ 2、關(guān)于1的問題，我想到在單酶切載體，為了防止自身環(huán)化而用堿性磷酸酶把載體的5`端磷酸集團(tuán)轉(zhuǎn)為羥基，那目的片段再連接的時(shí)候是怎么連上的？ |
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2樓2017-07-27 14:18:14
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3樓2017-07-28 09:25:41
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勝哥的歌4樓2017-07-28 10:20:00
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繼續(xù)求教： 在拿到PLKO.1以后，我進(jìn)行了第一次小提和大提，后面也插入了我自己連接的ShRNA片段。為了后續(xù)驗(yàn)證，在目的片段的設(shè)計(jì)中加入了一個(gè)KpnI酶切位點(diǎn)，原本載體上就有一個(gè)KpnI位點(diǎn)，那么如果我的目的片段成功連接，那只用KpnI就能切出一大一小兩個(gè)片段，小片段1400左右。結(jié)果。。。。。我切出來的有2000.。。。。。。然后我返回去那我第一次大提的沒有連接目的片段的載體切，KpnI切不出小片段，用KpnI+Agel也是2000！我暈了。。 按理說圖譜上切下來小片段只有1400左右的 幻燈片1.PNG 2.png |
5樓2017-07-28 10:27:27
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6樓2017-07-28 11:12:41
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7樓2017-07-28 11:13:44
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8樓2017-07-28 12:38:59
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9樓2017-07-28 16:14:49
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