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單酶切去磷酸化構(gòu)建的載體 已有3人參與
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用xbarI單酶切，去磷酸化后，構(gòu)建好了載體，測(cè)序沒問題，但單酶切驗(yàn)證就是切不下來，是什么原因？請(qǐng)各位大神賜教 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-08-13 08:55:49
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西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-08-13 08:55:49
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1、XbaI可能受dam甲基化影響, TCTAG(6m)ATC無法切開 2、NdeI+XbaI雙切不會(huì)有什么問題，但是Nde連接時(shí)需要使用平滑末端連接條件，不知你雙切后的載體做沒有作脫磷 3、為什么不先用你目的基因的PCR引物（包含完整序列）先做菌落PCR，能P出來肯定你插入的片斷是完整的。 4、不知道你的引物是和載體哪個(gè)部分互補(bǔ)的，1-3k的正反兩個(gè)通用引物就能測(cè)通了阿？ |
2樓2017-08-12 21:14:01
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已經(jīng)測(cè)通了，2k的序列都對(duì)，酶切位點(diǎn)也對(duì)，就是單酶切驗(yàn)證總是沒有目的片段 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2017-08-13 12:46:23
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構(gòu)建載體的時(shí)候就是用xbaI單酶切空載，去磷酸化后，與xbaI單酶切的目的片段連接，單克隆提質(zhì)粒后肯定有目的片段，測(cè)序測(cè)通了都沒問題，就是酶切驗(yàn)證切不下來 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-08-13 12:51:09
dehong1573
至尊木蟲 (正式寫手)
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5樓2017-08-15 17:03:28
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6樓2017-08-16 15:38:17
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