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蘿卜絲兒木蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助�。∞D(zhuǎn)質(zhì)粒出現(xiàn)問題了！
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從公司買來了一段基因（3.7kb），那段基因是連在公司提供的質(zhì)粒（2.7KB+3.7kb）上的，然后拿回來后就轉(zhuǎn)入E.coli，然后就是擴(kuò)增，提質(zhì)粒，酶切跑電泳，切膠回收（3.7kb），再把那個(gè)基因連到我們實(shí)驗(yàn)室自己構(gòu)建的載體（7.3kb）上，然后再做E.coli轉(zhuǎn)化，但是很妖的事情發(fā)生了�。⊥堪嬉院螅羧￠L出來的單克隆，擴(kuò)增，提質(zhì)粒，酶切鑒定，得出的結(jié)果是3.7kb+2.7kb。。。做了好多好多遍都是這個(gè)結(jié)果，然后還用了菌落pcr鑒定那個(gè)質(zhì)粒上的基因，結(jié)果是正確的。。這到底是怎么回事�。� 求各位幫忙�。�！師兄一開始認(rèn)為我實(shí)驗(yàn)技能不過關(guān)，然后自己上來做，也是這個(gè)情況，其他博后過來指導(dǎo)，結(jié)果也是這個(gè)，這到底是怎么回事��？去磷酸化也做過了，但還是這個(gè)情況。。。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
蘿卜絲兒(金幣+2): 2011-06-05 15:11:25
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超螺旋的速度可不是按規(guī)矩來的 你的沒有切開的部分質(zhì)粒是可以存在于你的大片段里的 你的對照做了嗎 有沒有直接把你回收的3.7kb片段做轉(zhuǎn)化？有沒有把你的3.7kb片段做一個(gè)自連，然后做轉(zhuǎn)化？如果這個(gè)沒做，說明你的實(shí)驗(yàn)本身設(shè)計(jì)就不夠完善 從你的描述看，首要的懷疑點(diǎn)就是沒完全切開，導(dǎo)致后續(xù)的失敗 其次，還有注意是不是你的菌在轉(zhuǎn)化似乎操作上污染，這樣問題也需要做一個(gè)轉(zhuǎn)化水的對照 你的問題是實(shí)驗(yàn)室做基因克隆常見的問題，一點(diǎn)都不詭異，見多了就自然不怪了， 順便批評一下你的一句話，確切的說是你的態(tài)度：" 操作方面絕對不存在問題" 新手以后切忌說這句話��！ 科研水深 |
8樓2011-05-30 11:59:22
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7樓2011-05-30 08:28:31
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