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點(diǎn)點(diǎn)招財(cái)貓銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
關(guān)于高通量測(cè)序后構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的相關(guān)問(wèn)題，有些細(xì)節(jié)不懂，希望大家?guī)蛶兔? 已有1人參與
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本人剛接觸分子生物信息學(xué)這一塊，最近剛開(kāi)始學(xué)習(xí)做系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，然后在做的過(guò)程中出現(xiàn)了很多的問(wèn)題，現(xiàn)在說(shuō)出來(lái)，希望做過(guò)的大神能夠給一些意見(jiàn)和建議。 我是測(cè)的高通量測(cè)序，做功能菌AOAAOB，因?yàn)楣δ芫虻淖⑨尳Y(jié)果不是很好，所以想要做一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育的進(jìn)化樹(shù)，來(lái)看看自己得到的OUT到底是屬于哪一個(gè)屬的，我的操作就是拿代表OUT的序列在BLAST上比對(duì)，然后勾選uncultured，會(huì)得到一些有具體菌種名稱(chēng)的序列，只是identity沒(méi)有100%，可能就是92%，94%之類(lèi)的，然后QUERY COVER也是有可能不會(huì)是100%，就99%，98%，97%這樣子的，就拿AOB舉例子來(lái)說(shuō)，我取豐度最高的前十代表OTU來(lái)按照上面的操作搜索參比序列，發(fā)現(xiàn)前十代表OTU的序列本身就比較相近，可能是土壤里面本身的菌落結(jié)構(gòu)比較單一，最后得到了一個(gè)比較粗糙的進(jìn)化樹(shù)。這個(gè)樹(shù)太粗糙以至于有些序列放了幾遍我也開(kāi)始沒(méi)發(fā)現(xiàn)。只是舉個(gè)例子而已。 現(xiàn)在存在的問(wèn)題如下： 1.我的代表OTU序列本身就比較相近，所以在進(jìn)化樹(shù)里面OTU自己都聚在了一起，而已經(jīng)的參比序列聚到了一起，而且盡管相似度都很高，但是自展值有的卻很低，有的也就是三十幾，四十幾，這完全沒(méi)有達(dá)到我的目的，看不出哪個(gè)OTU跟哪個(gè)菌比較近，不知道這種情況應(yīng)該怎么辦？怎么調(diào)整？ 2.我用blast找參比序列的時(shí)候是勾選了unclutured的，就是不知道在進(jìn)化樹(shù)能不能放入uncultured的菌屬，像我上面描述這樣子的操作到底可不可行？ 3.高通量序列測(cè)出來(lái)的有很多代表OTU序列，不知道是應(yīng)該放豐度前1%，還是放豐度排名前30位的OTU序列？ 4.一般都是會(huì)用親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)的序列作為根，親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)的序列如何找，如何確定？感覺(jué)自己找親緣關(guān)系遠(yuǎn)的或者近的都比較盲目。 5.有的文章中會(huì)在后面加上是哪些類(lèi)，比如是nitrosospira,nitrosomonas等，甚至有的是Group Ⅰ.1之類(lèi)的，就像知道如果序列是uncultured，那如何知道它是屬于哪個(gè)屬的？ 自己搞了一周了， 還不解，希望各位幫幫忙 屏幕快照 2017-11-30 下午2.47.22.png 屏幕快照 2017-11-30 下午2.47.32.png 屏幕快照 2017-11-30 下午2.48.00.png 1D8A9823-7B19-44C0-A928-44E047C560F0.png |
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 高通量測(cè)序 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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由于在微生物多樣性分析公司，雖然自己不是很精通，但是也自己操作過(guò)一點(diǎn)點(diǎn)，聽(tīng)同事也講過(guò)一點(diǎn)點(diǎn)，希望對(duì)你有幫助。 1 由于目前功能基因沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的數(shù)據(jù)庫(kù)，所以測(cè)序完成后，我們也是用NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)的。 2 由于環(huán)境中，沒(méi)有鑒別的微生物太多，注定環(huán)境樣本中uncultured的很多，unclassified的也很多。像我們給客戶(hù)做的結(jié)果，對(duì)于環(huán)境樣本，unclassified的很多，在種水平有的能達(dá)到80-90%。 3 做完了OTU注釋后，需要把相同種屬的在進(jìn)行一次整理。例如OTU1 、OTU30可能屬于同一種，注釋完成后，需要將他們重新再進(jìn)行整理，合并到一起。 4 BLAST比對(duì)后，至于選擇前10還是前30，每個(gè)公司不一致，這個(gè)也沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。 5 如果實(shí)在搞不懂，可以將你的數(shù)據(jù)部分外包給公司，然后看一下公司是怎么做的，請(qǐng)教一下公司技術(shù)人員，這樣理解學(xué)習(xí)起來(lái)會(huì)更快一些。 |
2樓2017-12-04 09:56:59
3樓2018-03-20 19:15:12
小肥兔擠
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 31.1
- 帖子: 59
- 在線: 14.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 4460546
- 注冊(cè): 2016-03-03
- 專(zhuān)業(yè): 海洋地質(zhì)學(xué)
4樓2019-11-21 10:08:23
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