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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 微生物 » 發(fā)酵/表達 » 純化，異源表達
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[求助]
純化，異源表達 已有1人參與
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我是做酶的，我在異源表達好后，培養(yǎng)破碎得到粗酶液，檢測有活性，但是在做鎳柱純化時，感覺蛋白不掛柱子，我是在蛋白質雙端都加上了6xhis標簽，求大神們，幫忙解答一下，該怎么做。 @天使托 發(fā)自小木蟲手機客戶端 |
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- 專業(yè): 系統(tǒng)生物學
2樓2026-01-20 13:57:09
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謝謝，這個是可溶性蛋白，我每次都是破碎得到粗酶液，然后12000rpm離心20min后去檢測上清液的酶活的，有酶活后再去做的純化，純化時反復用粗酶液過柱子3-4遍，然后先用40mM的咪唑溶液洗去雜蛋白，100-500mM咪唑溶液探究目的蛋白洗脫濃度，用蛋白質定量試劑G250實時檢測洗脫液中蛋白濃度，但是做了幾次都是40mM就洗出來了大部分蛋白，然后100mM洗出一點，200-500逐漸減少了，每個濃度洗脫液都用了四杯柱，用底物檢測酶活時，過柱子剩下的粗酶液中酶活最高，40mM咪唑溶液中酶活較高，100-500與前者比斷檔級降低。 發(fā)自小木蟲手機客戶端 |
3樓2026-01-20 16:23:00
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蛋白膠我正在做，等出來再看看結果，其實有人推薦我用MBP大標簽，但是這個標簽可能會影響酶的空間結構進而影響酶活，最主要的是這個表簽需要切除，酶切反應要過夜，所以無法第一時間進行實驗，一直在考慮要不要用，想問一下大家還有沒有什么好的方法。  發(fā)自小木蟲手機客戶端 |
4樓2026-01-20 16:26:54
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