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【分享】realtime pcr 個人經(jīng)驗分享
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2009年的下半年我一直在跟RNA提取、逆轉錄和SYBR GREEN realtime-PCR反應做斗爭，現(xiàn)在已經(jīng)告別當初的迷茫，當別人問自己的時候，也能說出個一二五來了，很高興。當時在我艱難摸索的時候就想，等我都學會了，我一定要寫篇帖子，把一個初學者最初的想法和覺得矛盾、困難、不知如何入手的方法、難點和最后解決的辦法寫出來，一來可以幫助更多像我這樣的人，二來也算讓自己有點成就感了，三就是希望版主給我加點分數(shù)了。呵呵。好了，現(xiàn)在開始吧。 1. ABI7000的儀器如何做溶解曲線：我們單位剛開始的時候只有一臺儀器ABI7000，其他人都是用taqman探針做的，而且只是對結果進行定性分析。我用的是SYBR green 染料，是需要做溶解曲線的，關于設置的問題就來了，設置好PCR的程序以后，在程序下方有一個框框，具體我忘了，把那個框框打上勾就好了,溶解曲線的溫度是不能高于60的，所以我的有部分產(chǎn)物解鏈溫度太高了，出來的溶解曲線只能出來半側峰或者沒有峰。后來單位又購進了一臺ROCHE 480 lightcycleR能設置溶解曲線的反應程序，這個問題就解決了。 2. 閾值的調整：一般設在最大熒光信號的1/5,或是R2最大時的CT值為閾值標準，根據(jù)不同的儀器選擇。 3. 擴增效率的問題：lightcycle擴增效率在1.9-2.05之間認為結果是可以應用的，有可比性。其它儀器是90-105%，因為我沒用過其它的儀器，有見過這種儀器類型的網(wǎng)友可以補充一下。 4. realtime pcr的重復性問題：通常相同試劑、相同模版、同一個反映條件CT不要相差一個循環(huán)以外。比如復孔。 5. 梯度稀釋問題：將模版10倍稀釋后，每個梯度CT值相差要控制在3.3-3.5個循環(huán)之間。 如果CT值超過30個循環(huán)以后，就不適宜做梯度稀釋了，因為這個時候濃度太低，定量本來就不準，所以梯度稀釋結果不能用作參考的。 6. 標準曲線：通常有些人做很多標本，要用不同的pcr反應板，不能同時一次進行，這時每個反應板最好做標準曲線，斜率相差小于0.1，結果可認為具有可比性。且擴增斜率要在-3.6到-3.1之間結果最好。當然了，這個時候因為每個板都做標準曲線了，分析的時候既可以用detadetaCT法，也可以用雙標準曲線法了。 7. 如何理解標本做復孔的問題：原來我一直都不理解標本做復孔的問題，就是不知道怎么做，我以為是一個標本，在不同的反應板里做3次，取平均結果，同一個實驗室里也沒人做過的，后來問同學，才知道，在這里謝謝她了。 過程如下：20ul體系，比如說你要做10個標本，每個標本要做3個復孔，就先準備10*3+大約5個標本的母液（含酶、realtimepcr的試劑等，但不包括模板），然后準備10個500ul的pcr管，每個分裝60ul。然后在分裝好的母液中加入3ul的模版，混勻后再分裝20ul到3個realtime反應孔中，這樣就說傳說的3個復孔了，避免了不同批次、加樣等等誤差。 注：這里考慮浪費，所以母液分裝時多準備了；且分裝模板混合物時轉速不要太大，基本上1000-1500幾秒就夠了，要不然酶會下沉，我通常是混勻兩次離心兩次再分裝。 8. 關于結果分析：我想所有做過realtimepcr的人都熟悉那個很復雜的公式吧。又samplA又samplB 又 target 又reference我當時就苦苦考慮了我的實驗當中到底哪個充當reference的角色，偶爾在論壇上看到一篇文獻，具體我也忘了，大體就是說如果是討論兩組時間的表達量差異，那個reference是可以不要的，指數(shù)直接是同一個標本的-（目標基因-管家基因的ct）就可以了。 9. 關于realtimepcr優(yōu)化的問題：關于這個問題真是浪費我不少錢了，現(xiàn)在我把我的秘密告訴大家吧，呵呵， 9.1 先跑普通PCR看看你的引物有沒有問題，正常的產(chǎn)物能不能出來。一切正常的話就上realtime pcr吧。 9.2 realtime pcr時所有反應的ct值必須控制在12-30個循環(huán)之間，結果才有可比性。我的管家基因ct值已經(jīng)到了13-17之間了，但是我目標基因已經(jīng)在30個循環(huán)之外了，表達量很低，詢問了roche的工程師，他說我的管家基因表達量太高了，最好換下別的管家基因，或是提高目標基因的表達量，我想他是對的。 9.3 關于控制非特異性擴增的問題，除了看溶解曲線之外，另外一個方法是我非常推崇的，我現(xiàn)在還很后悔我沒有早早的用這個方法，以至于浪費了很多錢，那就是采用realtime pcr產(chǎn)物去跑膠2.5%瓊脂糖，我上樣10ul，好的反應真是一點雜帶沒有，不好的話雜帶好多，嗚嗚嗚，這個方法真是很靈敏的，根據(jù)結果乖乖的調整你的反應條件吧，或者就是重新選引物了。不過我看ABI7000的儀器說明，好像說是你要是用PCR產(chǎn)物跑膠的話不能做溶解曲線，不知道是不是這樣，我沒研究過。 10 引物長度 sybr green的片段長度最好不要超過300bp，但是我做了580bp的結果和300bp左右的結果差不多。Taqman的話估計得150bp以下不能太高了。2010.2.8應iamxetu提醒修改。 11 關于標準物的問題 我原來還想我到底去哪里找標準物好呢，真是個大問題，最后問了ROCHE的工程師，他說你的實驗只是相對定量，只要隨便選個樣品作為標準品都可以的，我用了他的方法。不過選標準品的時候要注意選個表達量高的哦，要不然你最高濃度的時候已經(jīng)20ct了，再稀釋4個濃度，低濃度到30ct以外就不好了。 12 總RNA被DNA污染的問題：我提取的是細菌總RNA，DNA污染真是不可避免，最后用了寶xx的DNase1，按照它的說明書進行，結果很麻煩，我做的時候常常讓我崩潰，后來我看了別的廠家的，比如說Axx，方法簡單多了，別的網(wǎng)友可以考慮下，不過也要考慮錢的問題了。 13 凡是做溶解曲線的realtime pcr反應，在pcr擴增完成以后會看見擴增曲線最后有一個下降的曲線，不要大驚小怪，因為儀器要接著做溶解曲線了，原理我不懂，但是這是正常的。 14 溶解曲線的雜峰判斷 網(wǎng)友的經(jīng)驗，在70-75度左右出現(xiàn)的雜峰一般為引物二聚體。 15.2010.2.8加上 稀釋CDNA: 我稀釋cDNA的時候犯了一個嚴重的錯誤，說出來也許對網(wǎng)友有所幫助。我逆轉錄了500ng的總RNA20ul,cDNA的濃度應該是25ng/ul，但是我當成是500ng/ul的濃度稀釋了，稀釋成5ng/ul的濃度，稀釋完了以后我就先做內參，結果正常，但是做目標基因的時候發(fā)現(xiàn)不對了，CT值都在35以上，開始找原因，才知道稀釋錯了。當時好郁悶，浪費了好多easy dilution and sybr green realtime pcr試劑，浪費了很多錢，而且重新買試劑也耽誤了好長時間，寫在這里是提醒網(wǎng)友們做的時候千萬別弄錯了。 好了，我想說的問題就這些了，當時真的是很困擾我的問題，里面的經(jīng)驗大多我從網(wǎng)上看到的然后自己實踐的，要是哪里說的不對，或是有更好的方法給我指出來吧。我也想學習學習。謝謝了。 |
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謝謝樓主的經(jīng)驗。 能否解答一下我的問題，謝謝 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=1967712&fpage=1 |
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采用realtime pcr產(chǎn)物去跑膠2.5%瓊脂糖，請問樓主這里寫的產(chǎn)物跑2.5%的膠，是多大的產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖膠？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
42樓2021-03-03 10:33:59
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ycl3156樓
2010-02-21 11:33
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aegeand22樓
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