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【分享】realtime pcr 個(gè)人經(jīng)驗(yàn)分享
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2009年的下半年我一直在跟RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和SYBR GREEN realtime-PCR反應(yīng)做斗爭(zhēng)，現(xiàn)在已經(jīng)告別當(dāng)初的迷茫，當(dāng)別人問自己的時(shí)候，也能說出個(gè)一二五來了，很高興。當(dāng)時(shí)在我艱難摸索的時(shí)候就想，等我都學(xué)會(huì)了，我一定要寫篇帖子，把一個(gè)初學(xué)者最初的想法和覺得矛盾、困難、不知如何入手的方法、難點(diǎn)和最后解決的辦法寫出來，一來可以幫助更多像我這樣的人，二來也算讓自己有點(diǎn)成就感了，三就是希望版主給我加點(diǎn)分?jǐn)?shù)了。呵呵。好了，現(xiàn)在開始吧。 1. ABI7000的儀器如何做溶解曲線：我們單位剛開始的時(shí)候只有一臺(tái)儀器ABI7000，其他人都是用taqman探針做的，而且只是對(duì)結(jié)果進(jìn)行定性分析。我用的是SYBR green 染料，是需要做溶解曲線的，關(guān)于設(shè)置的問題就來了，設(shè)置好PCR的程序以后，在程序下方有一個(gè)框框，具體我忘了，把那個(gè)框框打上勾就好了,溶解曲線的溫度是不能高于60的，所以我的有部分產(chǎn)物解鏈溫度太高了，出來的溶解曲線只能出來半側(cè)峰或者沒有峰。后來單位又購(gòu)進(jìn)了一臺(tái)ROCHE 480 lightcycleR能設(shè)置溶解曲線的反應(yīng)程序，這個(gè)問題就解決了。 2. 閾值的調(diào)整：一般設(shè)在最大熒光信號(hào)的1/5,或是R2最大時(shí)的CT值為閾值標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)不同的儀器選擇。 3. 擴(kuò)增效率的問題：lightcycle擴(kuò)增效率在1.9-2.05之間認(rèn)為結(jié)果是可以應(yīng)用的，有可比性。其它儀器是90-105%，因?yàn)槲覜]用過其它的儀器，有見過這種儀器類型的網(wǎng)友可以補(bǔ)充一下。 4. realtime pcr的重復(fù)性問題：通常相同試劑、相同模版、同一個(gè)反映條件CT不要相差一個(gè)循環(huán)以外。比如復(fù)孔。 5. 梯度稀釋問題：將模版10倍稀釋后，每個(gè)梯度CT值相差要控制在3.3-3.5個(gè)循環(huán)之間。 如果CT值超過30個(gè)循環(huán)以后，就不適宜做梯度稀釋了，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候濃度太低，定量本來就不準(zhǔn)，所以梯度稀釋結(jié)果不能用作參考的。 6. 標(biāo)準(zhǔn)曲線：通常有些人做很多標(biāo)本，要用不同的pcr反應(yīng)板，不能同時(shí)一次進(jìn)行，這時(shí)每個(gè)反應(yīng)板最好做標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率相差小于0.1，結(jié)果可認(rèn)為具有可比性。且擴(kuò)增斜率要在-3.6到-3.1之間結(jié)果最好。當(dāng)然了，這個(gè)時(shí)候因?yàn)槊總�(gè)板都做標(biāo)準(zhǔn)曲線了，分析的時(shí)候既可以用detadetaCT法，也可以用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法了。 7. 如何理解標(biāo)本做復(fù)孔的問題：原來我一直都不理解標(biāo)本做復(fù)孔的問題，就是不知道怎么做，我以為是一個(gè)標(biāo)本，在不同的反應(yīng)板里做3次，取平均結(jié)果，同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室里也沒人做過的，后來問同學(xué)，才知道，在這里謝謝她了。 過程如下：20ul體系，比如說你要做10個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本要做3個(gè)復(fù)孔，就先準(zhǔn)備10*3+大約5個(gè)標(biāo)本的母液（含酶、realtimepcr的試劑等，但不包括模板），然后準(zhǔn)備10個(gè)500ul的pcr管，每個(gè)分裝60ul。然后在分裝好的母液中加入3ul的模版，混勻后再分裝20ul到3個(gè)realtime反應(yīng)孔中，這樣就說傳說的3個(gè)復(fù)孔了，避免了不同批次、加樣等等誤差。 注：這里考慮浪費(fèi)，所以母液分裝時(shí)多準(zhǔn)備了；且分裝模板混合物時(shí)轉(zhuǎn)速不要太大，基本上1000-1500幾秒就夠了，要不然酶會(huì)下沉，我通常是混勻兩次離心兩次再分裝。 8. 關(guān)于結(jié)果分析：我想所有做過realtimepcr的人都熟悉那個(gè)很復(fù)雜的公式吧。又samplA又samplB 又 target 又reference我當(dāng)時(shí)就苦苦考慮了我的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中到底哪個(gè)充當(dāng)reference的角色，偶爾在論壇上看到一篇文獻(xiàn)，具體我也忘了，大體就是說如果是討論兩組時(shí)間的表達(dá)量差異，那個(gè)reference是可以不要的，指數(shù)直接是同一個(gè)標(biāo)本的-（目標(biāo)基因-管家基因的ct）就可以了。 9. 關(guān)于realtimepcr優(yōu)化的問題：關(guān)于這個(gè)問題真是浪費(fèi)我不少錢了，現(xiàn)在我把我的秘密告訴大家吧，呵呵， 9.1 先跑普通PCR看看你的引物有沒有問題，正常的產(chǎn)物能不能出來。一切正常的話就上realtime pcr吧。 9.2 realtime pcr時(shí)所有反應(yīng)的ct值必須控制在12-30個(gè)循環(huán)之間，結(jié)果才有可比性。我的管家基因ct值已經(jīng)到了13-17之間了，但是我目標(biāo)基因已經(jīng)在30個(gè)循環(huán)之外了，表達(dá)量很低，詢問了roche的工程師，他說我的管家基因表達(dá)量太高了，最好換下別的管家基因，或是提高目標(biāo)基因的表達(dá)量，我想他是對(duì)的。 9.3 關(guān)于控制非特異性擴(kuò)增的問題，除了看溶解曲線之外，另外一個(gè)方法是我非常推崇的，我現(xiàn)在還很后悔我沒有早早的用這個(gè)方法，以至于浪費(fèi)了很多錢，那就是采用realtime pcr產(chǎn)物去跑膠2.5%瓊脂糖，我上樣10ul，好的反應(yīng)真是一點(diǎn)雜帶沒有，不好的話雜帶好多，嗚嗚嗚，這個(gè)方法真是很靈敏的，根據(jù)結(jié)果乖乖的調(diào)整你的反應(yīng)條件吧，或者就是重新選引物了。不過我看ABI7000的儀器說明，好像說是你要是用PCR產(chǎn)物跑膠的話不能做溶解曲線，不知道是不是這樣，我沒研究過。 10 引物長(zhǎng)度 sybr green的片段長(zhǎng)度最好不要超過300bp，但是我做了580bp的結(jié)果和300bp左右的結(jié)果差不多。Taqman的話估計(jì)得150bp以下不能太高了。2010.2.8應(yīng)iamxetu提醒修改。 11 關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)物的問題 我原來還想我到底去哪里找標(biāo)準(zhǔn)物好呢，真是個(gè)大問題，最后問了ROCHE的工程師，他說你的實(shí)驗(yàn)只是相對(duì)定量，只要隨便選個(gè)樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品都可以的，我用了他的方法。不過選標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)候要注意選個(gè)表達(dá)量高的哦，要不然你最高濃度的時(shí)候已經(jīng)20ct了，再稀釋4個(gè)濃度，低濃度到30ct以外就不好了。 12 總RNA被DNA污染的問題：我提取的是細(xì)菌總RNA，DNA污染真是不可避免，最后用了寶xx的DNase1，按照它的說明書進(jìn)行，結(jié)果很麻煩，我做的時(shí)候常常讓我崩潰，后來我看了別的廠家的，比如說Axx，方法簡(jiǎn)單多了，別的網(wǎng)友可以考慮下，不過也要考慮錢的問題了。 13 凡是做溶解曲線的realtime pcr反應(yīng)，在pcr擴(kuò)增完成以后會(huì)看見擴(kuò)增曲線最后有一個(gè)下降的曲線，不要大驚小怪，因?yàn)閮x器要接著做溶解曲線了，原理我不懂，但是這是正常的。 14 溶解曲線的雜峰判斷 網(wǎng)友的經(jīng)驗(yàn)，在70-75度左右出現(xiàn)的雜峰一般為引物二聚體。 15.2010.2.8加上 稀釋CDNA: 我稀釋cDNA的時(shí)候犯了一個(gè)嚴(yán)重的錯(cuò)誤，說出來也許對(duì)網(wǎng)友有所幫助。我逆轉(zhuǎn)錄了500ng的總RNA20ul,cDNA的濃度應(yīng)該是25ng/ul，但是我當(dāng)成是500ng/ul的濃度稀釋了，稀釋成5ng/ul的濃度，稀釋完了以后我就先做內(nèi)參，結(jié)果正常，但是做目標(biāo)基因的時(shí)候發(fā)現(xiàn)不對(duì)了，CT值都在35以上，開始找原因，才知道稀釋錯(cuò)了。當(dāng)時(shí)好郁悶，浪費(fèi)了好多easy dilution and sybr green realtime pcr試劑，浪費(fèi)了很多錢，而且重新買試劑也耽誤了好長(zhǎng)時(shí)間，寫在這里是提醒網(wǎng)友們做的時(shí)候千萬別弄錯(cuò)了。 好了，我想說的問題就這些了，當(dāng)時(shí)真的是很困擾我的問題，里面的經(jīng)驗(yàn)大多我從網(wǎng)上看到的然后自己實(shí)踐的，要是哪里說的不對(duì)，或是有更好的方法給我指出來吧。我也想學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)。謝謝了。 |
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