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[交流]
【求助】超氧化物歧化酶活性測(cè)定方法 已有3人參與
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| 請(qǐng)教一下各位高手，有誰(shuí)在做植物體超氧化物歧化酶活性試驗(yàn)的測(cè)定嗎？或者哪位有測(cè)定方法�。ㄗ詈檬菢�(biāo)準(zhǔn)操作方法）跪求。急切盼望回帖。謝謝！ |
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3樓2010-05-07 15:24:40
hha123
金蟲 (正式寫手)
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2814502(金幣+1):謝謝 2010-05-07 15:22:16
kolkata(金幣+2):謝謝應(yīng)助。不錯(cuò)，鼓勵(lì)一下。 2010-05-14 21:48:31
2814502(金幣+1):謝謝 2010-05-07 15:22:16
kolkata(金幣+2):謝謝應(yīng)助。不錯(cuò)，鼓勵(lì)一下。 2010-05-14 21:48:31
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超氧化物歧化酶(suPeroXIde dIsMuTAse，簡(jiǎn)稱SOD)是需氧生物中普遍存在的一種含金屬酶。它與過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶等酶協(xié)同作用防御活性氧或其他過(guò)氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害；超氧化物歧化酶可以催化氧自由基的歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫又可以被過(guò)氧化氫酶轉(zhuǎn)化成無(wú)害的分子氧和水。 2O-2＋2HH2O2＋O2 2H2O22H2O＋O2 已知此酶活力與植物抗逆性及衰老有密切關(guān)系，故成為植物逆境生理學(xué)的重要研究對(duì)象。 【原理】 依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑(NBT)在光下的還原作用來(lái)確定酶活性大小。在有可氧化物存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2，O2可將NBT還原為藍(lán)色的甲，后者在560nM處有最大吸收。而超氧化物歧化酶作為氧自由基的清除劑可抑制此反應(yīng)。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一個(gè)酶活單位定義為將NBT的還原抑制到對(duì)照一半(50％)時(shí)所需的酶量。 【儀器與用具】 高速臺(tái)式離心機(jī)；分光光度計(jì)；微量進(jìn)樣器；熒光燈(反應(yīng)試管處照度為4000lX)；15MM×150MM試管；黑色硬紙?zhí)住?br /> 【試劑】 0.05Mol／L磷酸緩沖液(PH78)； 提取介質(zhì)50MMol／L PH78磷酸緩沖液(內(nèi)含1％聚乙烯吡咯烷酮)； 130MMol／L甲硫氨酸(MeT)溶液：稱1339g MeT，用磷酸緩沖液溶解并定容至100Ml； 750μMol／LNBT：稱取0.0613g NBT，用磷酸緩沖液溶解并定容至100Ml，避光保存； 100μMol／L核黃素溶液提0.0075g，定容至100Ml，避光保存，隨用隨配，并稀釋10倍。 【方法】 1.酶液提取取一定部位的植物葉片(視需要定，去葉脈)0.5g于預(yù)冷的研體中，加2Ml預(yù)冷的提取介質(zhì)在冰浴下研磨成勻漿，加入提取介質(zhì)沖洗研缽，并使終體積為10Ml。取5Ml于4℃下10 000r／Min離心15Min，上清液即為SOD粗提液。 2.顯色反應(yīng)取透明度、質(zhì)地相同的15MM×150MM試管4支，2支為測(cè)定、2支為對(duì)照，按表22-1加入試劑。 混勻后，給1支對(duì)照管罩上比試管稍長(zhǎng)的雙層黑色硬紙?zhí)渍诠�，與其他各管同時(shí)置于4000lx日光燈下反應(yīng)20～30Min(要求各管照光情況一致，反應(yīng)溫度控制在25～35℃之間，視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間)。 3SOD活性測(cè)定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，用黑布罩蓋上試管，終止反應(yīng)。以遮光的對(duì)照管作為空白，分別在560nM波長(zhǎng)下測(cè)定各管的吸光度，按式22-1計(jì)算SOD活性。 表22-1顯色反應(yīng)試劑配制表 試劑名稱用量（ml)終濃度（比色時(shí)）0.05mol/L磷酸緩沖液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol750μmol/L NBT溶液0.375μmol100μmol/L EDTA-Na2液0.310μmol20μmol/L核黃素0.32.0μmol酶液0.10對(duì)照2支管以緩沖液代替蒸餾水0.5總體積3.3SOD活性＝(A0-As)×VTA0×0.5×FW×V1（22-1） SOD比活力＝SOD總活性蛋白質(zhì)濃度（22-2） 式中SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以每毫克蛋白酶單位、酶單位／Mg表示； A0：照光對(duì)照光管的光吸收值； AS：樣品管的光吸收值； VT：樣液總體積(Ml)； V1：測(cè)定時(shí)樣品用量(Ml)； ＦW：樣品鮮重(g)； 蛋白質(zhì)濃度單位為每克鮮重含蛋白毫克數(shù)(Mg／g)。 【附注】 當(dāng)測(cè)定樣品數(shù)量較大時(shí)，可在臨用前根據(jù)用量將表22-1中各試劑(酶液和核黃素除外)按比例混合后一次加入290Ml，然后依次加入核黃素和酶液，使終濃度不變，其余各步與上相同。 |
2樓2010-05-06 16:09:35
hha123
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5樓2010-05-14 16:08:17
lxctszcg
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6樓2013-06-15 12:31:12
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