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[交流]
【求助】超氧化物歧化酶活性測定方法 已有3人參與
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| 請教一下各位高手，有誰在做植物體超氧化物歧化酶活性試驗的測定嗎？或者哪位有測定方法�。ㄗ詈檬菢藴什僮鞣椒ǎ┕蚯�。急切盼望回帖。謝謝！ |
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hha123
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5樓2010-05-14 16:08:17
hha123
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★ ★
2814502(金幣+1):謝謝 2010-05-07 15:22:16
kolkata(金幣+2):謝謝應助。不錯，鼓勵一下。 2010-05-14 21:48:31
2814502(金幣+1):謝謝 2010-05-07 15:22:16
kolkata(金幣+2):謝謝應助。不錯，鼓勵一下。 2010-05-14 21:48:31
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超氧化物歧化酶(suPeroXIde dIsMuTAse，簡稱SOD)是需氧生物中普遍存在的一種含金屬酶。它與過氧化物酶、過氧化氫酶等酶協(xié)同作用防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害；超氧化物歧化酶可以催化氧自由基的歧化反應，生成過氧化氫，過氧化氫又可以被過氧化氫酶轉(zhuǎn)化成無害的分子氧和水。 2O-2＋2HH2O2＋O2 2H2O22H2O＋O2 已知此酶活力與植物抗逆性及衰老有密切關(guān)系，故成為植物逆境生理學的重要研究對象。 【原理】 依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍四唑(NBT)在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有可氧化物存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2，O2可將NBT還原為藍色的甲，后者在560nM處有最大吸收。而超氧化物歧化酶作為氧自由基的清除劑可抑制此反應。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一個酶活單位定義為將NBT的還原抑制到對照一半(50％)時所需的酶量。 【儀器與用具】 高速臺式離心機；分光光度計；微量進樣器；熒光燈(反應試管處照度為4000lX)；15MM×150MM試管；黑色硬紙?zhí)住?br /> 【試劑】 0.05Mol／L磷酸緩沖液(PH78)； 提取介質(zhì)50MMol／L PH78磷酸緩沖液(內(nèi)含1％聚乙烯吡咯烷酮)； 130MMol／L甲硫氨酸(MeT)溶液：稱1339g MeT，用磷酸緩沖液溶解并定容至100Ml； 750μMol／LNBT：稱取0.0613g NBT，用磷酸緩沖液溶解并定容至100Ml，避光保存； 100μMol／L核黃素溶液提0.0075g，定容至100Ml，避光保存，隨用隨配，并稀釋10倍。 【方法】 1.酶液提取取一定部位的植物葉片(視需要定，去葉脈)0.5g于預冷的研體中，加2Ml預冷的提取介質(zhì)在冰浴下研磨成勻漿，加入提取介質(zhì)沖洗研缽，并使終體積為10Ml。取5Ml于4℃下10 000r／Min離心15Min，上清液即為SOD粗提液。 2.顯色反應取透明度、質(zhì)地相同的15MM×150MM試管4支，2支為測定、2支為對照，按表22-1加入試劑。 混勻后，給1支對照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬紙?zhí)渍诠�，與其他各管同時置于4000lx日光燈下反應20～30Min(要求各管照光情況一致，反應溫度控制在25～35℃之間，視酶活性高低適當調(diào)整反應時間)。 3SOD活性測定與計算至反應結(jié)束后，用黑布罩蓋上試管，終止反應。以遮光的對照管作為空白，分別在560nM波長下測定各管的吸光度，按式22-1計算SOD活性。 表22-1顯色反應試劑配制表 試劑名稱用量（ml)終濃度（比色時）0.05mol/L磷酸緩沖液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol750μmol/L NBT溶液0.375μmol100μmol/L EDTA-Na2液0.310μmol20μmol/L核黃素0.32.0μmol酶液0.10對照2支管以緩沖液代替蒸餾水0.5總體積3.3SOD活性＝(A0-As)×VTA0×0.5×FW×V1（22-1） SOD比活力＝SOD總活性蛋白質(zhì)濃度（22-2） 式中SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以每毫克蛋白酶單位、酶單位／Mg表示； A0：照光對照光管的光吸收值； AS：樣品管的光吸收值； VT：樣液總體積(Ml)； V1：測定時樣品用量(Ml)； ＦW：樣品鮮重(g)； 蛋白質(zhì)濃度單位為每克鮮重含蛋白毫克數(shù)(Mg／g)。 【附注】 當測定樣品數(shù)量較大時，可在臨用前根據(jù)用量將表22-1中各試劑(酶液和核黃素除外)按比例混合后一次加入290Ml，然后依次加入核黃素和酶液，使終濃度不變，其余各步與上相同。 |
2樓2010-05-06 16:09:35
3樓2010-05-07 15:24:40
lxctszcg
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