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花底離愁新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】生物小實(shí)驗(yàn)求助 已有3人參與
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| 請(qǐng)問(wèn),我要篩8個(gè)物種的SSR引物通用性及多態(tài)性。我現(xiàn)在打算先隨機(jī)拿一個(gè)物種出來(lái)進(jìn)行初篩,然后分析這個(gè)物種的引物在其他物種中的通用性。那我PCR的時(shí)候,每個(gè)PCR體系和程序會(huì)要變嗎?每一個(gè)都要優(yōu)化嗎?還有聚丙烯酰胺的電泳圖怎么看呢?怎么分析多態(tài)性呢?非常之感謝啊 |
新蟲(chóng) (初入文壇)
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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我覺(jué)得你現(xiàn)在這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的就有點(diǎn)問(wèn)題,你不能拿其中一個(gè)物種來(lái)初篩,這樣很有可能,原本在其他物種中可以成功擴(kuò)增的引物,因?yàn)樵谶@個(gè)物種中無(wú)法擴(kuò)增而被你拋棄。 所以,我認(rèn)為目前最合理的方法是將八個(gè)物種的DNA混合,獲得基因池,用基因池來(lái)篩選引物,這樣就不會(huì)出現(xiàn)漏掉某個(gè)引物的情況了。 PCR體系對(duì)于微衛(wèi)星來(lái)說(shuō),使用酶說(shuō)明書(shū)的肯定沒(méi)有任何問(wèn)題,基本不需要調(diào)整 PCR程序需要優(yōu)化,退火溫度需要調(diào)整,每個(gè)引物都有自己特異的溫度,這是做微衛(wèi)星相對(duì)麻煩的地方,如果你的PCR儀帶梯度,相對(duì)就簡(jiǎn)單一些。建議你做降落PCR,5度一篩基本上該能跑出來(lái)的都應(yīng)該能跑出來(lái),會(huì)簡(jiǎn)便很多 篩選微衛(wèi)星引物的原則: 1、目的大小處,有一條或兩條帶就算相對(duì)較好的引物(沒(méi)有雜帶最好,如果雜帶相距較遠(yuǎn),也可以忽略) 2、沒(méi)有擴(kuò)增出條帶的引物,降低退火溫度,如果溫度已降至45度以下仍無(wú)法成功擴(kuò)增該位點(diǎn),拋棄該引物,如果還想獲得該位點(diǎn),就需要重新設(shè)計(jì)引物 3、擴(kuò)增條帶模糊或者較淺的引物,稍微降低退火溫度即可 4、擴(kuò)增出現(xiàn)雜帶的引物,適當(dāng)升高退火溫度 5、如果所有個(gè)體都出相同的一條帶,被視為無(wú)多態(tài)性的位點(diǎn),通常拋棄該位點(diǎn)(當(dāng)然,不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡軟](méi)有多態(tài)的位點(diǎn)也是有意義的) [ Last edited by yujiaping1 on 2010-5-30 at 21:22 ] |
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