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新蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)

[交流] 【求助/交流】RNA中DNA污染物的去除 Fermentas的DNase I

fermentas 的DNASE1 RNA最好用DNase處理一下，于是訂購(gòu)了Fermentas的DNase I，（因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄盒子也是Fermentas）可一看說(shuō)明有點(diǎn)傻眼，本來(lái)是想找點(diǎn)捷徑，簡(jiǎn)化DNase消化，可是體系是這樣建議的：
Add to an RNase-free tube:
RNA 1μg
10X reaction buffer with MgCl2 1μl
DEPC-treated Water (#R0601) to 9μl
Deoxyribonuclease I (DNase I), RNase-free (1u/μl) 1μl (1u)
Note
If larger amounts of DNA-free RNA are required, the reaction
mixture should be scaled up.
Ribonuclease inhibitor (typically 1u/μl) can also be included in
the reaction mixture to prevent RNA degradation.
Incubate at 37°C for 30 minutes.
Add 1μl 25mM EDTA and incubate at 65°C for 10 minutes. RNA hydrolyzes during heating in the absence of a chelating agent (4).
Use the prepared RNA as a template for reverse
transcriptase.
這樣的話即便是RNA模板取1ug，那消化的這個(gè)體系也要配到11ul了，可是后面的逆轉(zhuǎn)錄盒子卻也不允許呀，如下：
Template RNA total RNA 0.1-5 μg
oligo (dT)18 primer 1 μl
DEPC-treated water to 12 μl
Total volume 12 μl
這樣的話，如果要是RNA模板采用1ug的話，那就不知怎么加入到逆轉(zhuǎn)錄體系了，量太大了，再者消化的體系會(huì)不會(huì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄有影響呢，因?yàn)镕ermentas的盒子并沒(méi)有說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題

試劑盒里說(shuō)可以直線擴(kuò)大體系然后用苯酚氯仿處理后再用乙醇洗
所以我就想知道除了以上方法有沒(méi)有什么更簡(jiǎn)便的方法可以處理
如果實(shí)在沒(méi)有，用苯酚氯仿處理后再用乙醇具體操作和條件是怎么樣的，能否告之
因?yàn)楹芗敝?麻煩大家了謝謝哈

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1樓 2010-05-27 22:06:10

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