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狄林銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】AFLP的產(chǎn)物片段大 已有4人參與
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最近做AFLP的預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物在200-2000bp,選擴(kuò)產(chǎn)物從200到2000以上均有拖帶,在大板上是顏色比較深的拖帶,沒有明顯條帶.以前同一連接產(chǎn)物預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物在100-1500bp,選擴(kuò)產(chǎn)物從200到750. 做過如下嘗試:換了內(nèi)切酶,引物,接頭,連接酶;mg離子減小到0.8;將酶用量加大一倍,時(shí)間延長到14h;預(yù)擴(kuò)退火溫度提高到58度;延伸時(shí)間都從2分減到1分;可選擴(kuò)產(chǎn)物片段還是在2000左右. 敬請高手指點(diǎn).謝謝! |
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2樓2010-06-17 14:26:50
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3樓2010-06-17 15:33:11
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4樓2010-06-17 16:38:10
狄林
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5樓2010-06-18 13:06:15
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★
dhd997(金幣+1):謝謝交流。 2010-06-18 14:39:36
狄林(金幣+3): 2010-06-18 20:41:54
dhd997(金幣+1):謝謝交流。 2010-06-18 14:39:36
狄林(金幣+3): 2010-06-18 20:41:54
| 首先你的預(yù)擴(kuò)大小就不對，說明應(yīng)該是之前的步驟出了問題，單酶切都可以切開，但是雙酶切時(shí)buffer變化了，是否切開了呢？我認(rèn)為問題還是出在酶切上，關(guān)鍵還是酶，從目前的大小判斷，可能出現(xiàn)問題的是多酶切位點(diǎn)的那個(gè)酶，不知道你用的是不是MseI，這個(gè)酶切不動(dòng)，主要考慮酶本身、buffer和BSA，至于時(shí)間，這個(gè)不重要 |
6樓2010-06-18 14:28:28
狄林
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7樓2010-06-18 20:48:24
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8樓2010-06-18 20:49:03
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9樓2010-06-18 22:10:11
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10樓2010-06-21 15:58:58
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