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qijing2010金蟲 (正式寫手)
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【分享】HPLC的詳細(xì)演講稿 已有3人參與
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第十三章 高效液相色譜法 第一節(jié) 概述 高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相 色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法 一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別 主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段 1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm 且不均勻 常壓輸送流動相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期長 無法在線檢測 2．HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動相 柱效高（H↓，n↑） 分析時間大大縮短 可以在線檢測 二、HPLC與GC差別 相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測 主要差別：分析對象的差別和流動相的差別 1．分析對象 GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品， 高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品不可檢測 占有機(jī)物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的樣品， 不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制 分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子 和離子型樣品均可檢測 用途廣泛，占有機(jī)物的80% 續(xù)前 2．流動相差別 GC：流動相為惰性氣體 組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用 HPLC：流動相為液體 流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、 改善分離度增加了因素，對分離起很大作用 流動相種類較多，選擇余地廣 流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用 選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相 可以增大分離選擇性 3．操作條件差別 GC：加溫操作 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬�。� 三、高效液相色譜儀流程圖 續(xù)前 四、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用 “三高” “一快” “一廣” 第二節(jié) 基本理論和條件選擇 一、塔板理論 二、速率理論 三、HPLC法中分離條件的選擇 一、塔板理論 二、速率理論（與GC對比） 續(xù)前 討論： 1）流動相流速對HPLC板高的影響（與GC對比）next 2）渦流擴(kuò)散項(xiàng)及其影響 next 圖示 back 續(xù)前 3）傳質(zhì)阻抗項(xiàng)及其影響 圖示 三、HPLC法中分離條件的選擇 1. 固定相與裝柱方法的選擇： 選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp≤10μm） 首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱 2. 流動相及其流速的選擇： 選粘度小、低流速的流動相——甲醇，1ml/min 3. 柱溫的選擇： 選室溫250C左右 第三節(jié) 各類高效液相色譜法 一、液固吸附色譜法（LSC） 二、液液分配色譜法（LLC） 三、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC） 一、液固吸附色譜法（LSC） 流動相為液體，固定相為固體吸附劑 1．分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性 中心能力的差異 分離前提：K不等或k不等 續(xù)前 2．固定相：與LC比，固定相粒徑不同（<10μm） 續(xù)前 3．流動相：底劑（烷烴）+ 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - - 4．影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動相性質(zhì)有關(guān) 溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑ 溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓， tR↓ 注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間 5．出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱 6．硅膠吸水量↑，LSC→LLC 硅膠含水量較小 吸附色譜 硅膠極性較大 硅膠含水量>17% 分配色譜 硅膠失活→載體 吸附的水→固定液 二、液液分配色譜法（LLC） 1．分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異 2．固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法） 缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用 固定液——極性→NLLC 固定液——非極性→RLLC 3．正相色譜——固定液極性 > 流動相極性（NLLC） 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適于分離極性組分 反相色譜——固定液極性 < 流動相極性（RLLC） 極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱 適于分離非極性組分 三、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC） （一）化學(xué)鍵合相 （二）反相鍵合相色譜 （三）正相鍵合相色譜 （四）離子對色譜和離子抑制色譜 （一）化學(xué)鍵合相 利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面 1．分離機(jī)制：分配 + 吸附（以LLC為基礎(chǔ)） 2．特點(diǎn)： 1）不易流失 2）熱穩(wěn)定性好 3）化學(xué)性能好 4）載樣量大 5）適于梯度洗脫 （二）反相鍵合相色譜 1．分離機(jī)制：疏溶劑理論 正相——流動相與溶質(zhì)排斥力強(qiáng)，作用時間↑ k↑，組分tR↑ 反相——流動相與溶質(zhì)排斥力弱，作用時間↓， k↓，組分tR↓ 2．固定相：極性小的烷基鍵合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC約80%問題） 3．流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水 流動相極性 > 固定相極性 底劑 + 有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF 續(xù)前 4．流動相極性與k的關(guān)系： 流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑ 5．出柱順序：極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱 6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題） （三）正相鍵合相色譜 1．分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、 誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力 2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相 3．流動相：極性�。ㄍ琇SC） 底劑 + 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 續(xù)前 4．流動相極性與k的關(guān)系： 流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓ 5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱 極性大的組分后出柱 6．適用： 氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍�。� 分離物質(zhì)也相似 氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性 分析極性大物質(zhì)、糖類等 （四）離子對色譜和離子抑制色譜 1．反相離子對色譜法 2．反相離子抑制色譜 1．反相離子對色譜法（IPC或PIC） 反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分 與其中的反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善分離 1）離子對試劑：烷基磺酸鈉→分析堿 四丁基季胺鹽→分析酸 2）影響k的因素 a．與m的極性有關(guān)（同反相色譜） b．與R的鏈長有關(guān)：R↑長，極性↓小，tR↑，k↑ 3）適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿 2．反相離子抑制色譜 在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制 組分解離，增加其k和tR，以達(dá)到改善分離的目的 1）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì) pH一定的緩沖溶液 2）k的影響因素：與流動相極性有關(guān)，還與pH值有關(guān) 選擇流動相：應(yīng)同時考慮極性及pH值 酸性物質(zhì)——加入酸HAc tR↑，k↑ 堿性物質(zhì)——加入堿NH3·H2O tR↑，k↑ 調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0 pH>8.0 破壞鍵合相與載體的結(jié)合 pH<3.0 腐蝕柱子 3）適用：極弱酸堿物質(zhì) pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物 第四節(jié) 影響分離的因素 1． 續(xù)前 2．對流動相的要求： 1）與固定液不反應(yīng) 2）對樣品有良好溶解度 k=1~10 k=2~5 最理想的 3）與檢測器匹配： UV（常用，測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長） 熒光，電化學(xué) 4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈） 使用前過濾、脫氣 續(xù)前 3．洗脫方式 1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫） 以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵） 類似GC的等溫度洗脫 2）梯度洗脫： 在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例 即不斷改變其極性（兩個泵） 適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分 類似GC的程序升溫（沸程較長樣品） 圖示 第五節(jié) 高效液相色譜儀 1．泵： 恒壓泵：流量精度不穩(wěn) 恒流泵：常用 2．進(jìn)樣裝置 1）隔膜進(jìn)樣（高分子有機(jī)硅膠墊→進(jìn)樣室） GC系統(tǒng)壓力較小，可以 HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進(jìn)樣（早期） 2）閥進(jìn)樣：不必停泵，六通閥 續(xù)前 3．色譜柱：直徑4~6mm,柱長10~30cm 柱效評價：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) R，n，fs（拖尾因子） 柱再生：維護(hù)、保養(yǎng)、柱子的沖洗 4．檢測器 1）紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質(zhì) 2）熒光檢測器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì) 靈敏度高 3）示差折光檢測器：利用折光率的差別 靈敏度低，溫度要求嚴(yán)格 4）電化學(xué)檢測器 5）化學(xué)發(fā)光 |
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