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juanjuanzi新蟲(chóng) (小有名氣)
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【分享】細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)個(gè)人總結(jié)1
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總結(jié)---細(xì)胞培養(yǎng) 一． 基本理論概論 原代培養(yǎng): 也叫初代培養(yǎng)，指直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱(chēng)為傳代或傳代培養(yǎng)。 細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物成功傳代后，則稱(chēng)之為細(xì)胞系。(如細(xì)胞系的生存期有限，則稱(chēng)之為有限細(xì)胞系；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系。) 細(xì)胞株：通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物稱(chēng)為細(xì)胞株。 培養(yǎng)類(lèi)型：細(xì)胞培養(yǎng)，組織培養(yǎng)，器官培養(yǎng)。 細(xì)胞生長(zhǎng)的方式：貼附生長(zhǎng)，懸浮生長(zhǎng) 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)（形態(tài)不一定，環(huán)境改變形態(tài)可能改變）：成纖維性型細(xì)胞，上皮型細(xì)胞（單層膜樣生長(zhǎng)），游走性細(xì)胞（游散生長(zhǎng)，常有偽足跟突起） 二． 培養(yǎng)過(guò)程及要點(diǎn)（切記無(wú)菌操作） （一） 工作環(huán)境的處理 1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % 酒精擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % 酒精擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。 2. 實(shí)驗(yàn)用品以70 %酒精擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在臺(tái)面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。 3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類(lèi)或是病毒 感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)(至少Class II)。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。 5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目： CO2 鋼瓶之CO2 壓力 。CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染(水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換)。 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300 小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。 （二） 試驗(yàn)用玻璃塑料用品清洗及其消毒滅菌 清洗： （1） 玻璃器皿的清洗（酸液由重鉻酸鉀，濃硫酸，蒸餾水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—沖洗 （2） 膠塞的清洗 剛買(mǎi)回的常含滑石粉等雜質(zhì)，先用自來(lái)水沖洗后再按常規(guī)方法處理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分鐘---1%稀Hcl浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘—晾干備用 （3） 塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡過(guò)夜—自來(lái)水沖洗--5%稀Hcl浸泡30分鐘—自來(lái)水和蒸餾水沖干備用。 消毒： （1） 物理消毒法（紫外線，濕熱，烘干，過(guò)濾）含碳酸氫鈉溶液要過(guò)濾，高壓會(huì)分解，培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃, 15 磅, 20 分鐘；布類(lèi)、玻璃制品、金屬器械等物品：先121℃, 15 磅, 20 分鐘，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干熱滅菌170℃, 4 小時(shí)。 （2） 化學(xué)消毒法（70%酒精，千分之一的新潔爾滅） （3） 抗生素：培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染 （三）培養(yǎng)物的污染及控制 污染種類(lèi)： （1） 細(xì)菌污染：培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。 （2） 真菌污染：培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。 （3） 支原體污染：培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。 （4） 病毒污染：盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。 （5） 非同種細(xì)胞污染： 污染來(lái)源： （1） 不潔的動(dòng)物組織標(biāo)本：正常情況下組織來(lái)源是不帶菌的，但由于取材不小心也會(huì)染菌，也有可能動(dòng)物體本身帶菌，不用濃的抗生素清洗，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)污染。 （2） 空氣：如果無(wú)菌操作區(qū)與外界隔離不嚴(yán)，空氣中會(huì)帶菌。其次，超凈臺(tái)使用過(guò)久，濾板堵塞也會(huì)污染。工作時(shí)不帶口罩外界氣流過(guò)強(qiáng)會(huì)污染。再者，南方空氣潮濕，空氣中容易帶菌，操作不注意會(huì)染菌。 （3） 清洗消毒：培養(yǎng)用液除菌不徹底，培養(yǎng)器具清洗消毒不徹底。 （4） 操作不過(guò)關(guān) 1、 實(shí)驗(yàn)前未檢查器械和液體是否污染 2、 操作者未帶口罩帽子，呼出空氣中含細(xì)菌和支原體 3、 培養(yǎng)瓶未用75%酒精擦拭和灼燒 4、 操作不當(dāng)吸管或培養(yǎng)用品接觸到污染物，如皮膚，瓶壁 5、 操作者說(shuō)話大聲，來(lái)回走動(dòng)，揚(yáng)起灰塵。 預(yù)防和控制 污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵。預(yù)防和避免污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購(gòu)置細(xì)胞，再培養(yǎng)。 預(yù)防 1、 培養(yǎng)用液、器皿要清洗消毒，防止污染。無(wú)菌室無(wú)菌器械要定期消毒 2、 操作者要細(xì)心穩(wěn)重。進(jìn)入無(wú)菌是前要用肥皂洗手，穿好隔離衣帽口罩，檢查物品無(wú)污染。進(jìn)入室內(nèi)要少說(shuō)話走動(dòng)打噴嚏要向背后，用酒精棉球擦手，瓶口，并灼燒瓶口。用酒精擦臺(tái)面，在超凈臺(tái)中央操作，切勿一根吸管用到底，要更換吸管，操作時(shí)吸管不能碰到培養(yǎng)瓶口，防止污染，試驗(yàn)完成要做好標(biāo)記。臨走帶走物品，用酒精擦臺(tái)面。不可直接進(jìn)行下一個(gè)試驗(yàn)。 3、 防止細(xì)胞交叉污染，及早留種保持，防止污染 控制 （一）、使用抗生素：一般對(duì)細(xì)菌有用。預(yù)防用藥比污染后用藥好，聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥好。一般用青霉素100u/ml,鏈霉素100ug/ml，清除用藥是常量的5-10倍采用5～10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規(guī)培養(yǎng)物，有時(shí)可能奏效。抗生素常用量和效果如果下： 抗生素 細(xì)菌 真菌 支原體 常用量 青霉素 G＋ 100u/ml 鏈霉素 G－ 100ug/ml 慶大霉素 G+/G- 200ug/ml 四環(huán)素 G+/G- 10ug/ml 卡那霉素 G+/G- 50ug/ml 兩性霉素B + 2ug/ml 制霉菌素 + 25ug/ml (二)、加溫除菌：根據(jù)支原體不耐熱的特點(diǎn)，可將受支原體污染的細(xì)胞至于41攝氏度作用5～10h（最長(zhǎng)可達(dá)18h），以殺滅支原體。但41攝氏度對(duì)細(xì)胞本身也有較大影響，故在處理前應(yīng)先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定出最大限度殺傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的最佳處理時(shí)間。 （三）、使用支原體特異性血清：抗血清結(jié)合支原體。一般支原體污染無(wú)太大價(jià)值均棄掉。 （四）、其他方法：動(dòng)物體內(nèi)接種除菌，加巨噬細(xì)胞。 動(dòng)物體內(nèi)接種：受污染的腫瘤細(xì)胞可接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔內(nèi)，利用動(dòng)物的免疫功能消滅污染的微生物，而腫瘤細(xì)胞卻能在動(dòng)物體內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，待一定時(shí)間后從體內(nèi)取出腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。 與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：巨噬細(xì)胞在體外可存活7～10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用這一特點(diǎn)，可將少量的污染細(xì)胞與足夠量的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，從而消除污染。 [ Last edited by juanjuanzi on 2010-7-9 at 09:54 ] |
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4樓2010-07-09 17:02:16
以后會(huì)用的上的，先謝過(guò)了 2樓2010-07-09 09:36:32
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3樓2010-07-09 10:19:07
juanjuanzi
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5樓2010-07-12 08:37:14
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