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vivihao金蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】熒光雙分子互補(bǔ)技術(shù) 已有2人參與
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有沒(méi)有哪個(gè)哥哥姐姐做過(guò)熒光雙分子互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究蛋白間的相互作用？小弟我現(xiàn)如今要做，不知道如何下手，首先構(gòu)建載體方面的問(wèn)題，如果我用GFP，譬如說(shuō)N端部分GFP是到第幾個(gè)氨基酸為止，C端部分GFP呢？ 看到有文獻(xiàn)說(shuō)N端GFP的第155或173個(gè)氨基酸位置后連著A蛋白核苷酸序列，余下的GFP蛋白的核苷酸序列連接B蛋白核苷酸序列。構(gòu)建好了2個(gè)載體同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，看有沒(méi)有熒光。 請(qǐng)問(wèn)大俠是不是這樣弄的？幫小弟解惑吧 |
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看天(金幣+3):如此的熱心 2010-07-09 18:16:06
vivihao(金幣+5):真的謝謝您了，那么熱心讓小弟很感動(dòng)。這2篇文獻(xiàn)我都看了，上面說(shuō)到在構(gòu)建載體的時(shí)候在N端GFP后還有加上一段幾個(gè)氨基酸組成的linker,而有的文獻(xiàn)上面沒(méi)有介紹��？不知道到底要不要加？我是做昆蟲(chóng)的，載體只能自己構(gòu)建，買了不了啊，悲劇 2010-07-12 10:23:59
看天(金幣+3):如此的熱心 2010-07-09 18:16:06
vivihao(金幣+5):真的謝謝您了，那么熱心讓小弟很感動(dòng)。這2篇文獻(xiàn)我都看了，上面說(shuō)到在構(gòu)建載體的時(shí)候在N端GFP后還有加上一段幾個(gè)氨基酸組成的linker,而有的文獻(xiàn)上面沒(méi)有介紹��？不知道到底要不要加？我是做昆蟲(chóng)的，載體只能自己構(gòu)建，買了不了啊，悲劇 2010-07-12 10:23:59
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你好！我?guī)湍銌?wèn)了一下！他們的BiFC載體是從公司購(gòu)買的，所以沒(méi)有自己去構(gòu)建，他們用的是YFP從155個(gè)氨基酸處插入，我也查了一部分文章，文章中指出 Geoffrey 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在GFP 的兩個(gè)β片層之間的環(huán)結(jié)構(gòu)上至少有10 個(gè)位點(diǎn)可以插入外源蛋白而不影響GFP 的熒光活性，但激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)會(huì)略有改變. 例在GFP 的第144 個(gè)和145 個(gè)氨基酸之間插入外源蛋白序列，用487 nm 波長(zhǎng)的光波激發(fā)后，仍能產(chǎn)生波長(zhǎng)為512 nm 的熒光. 附上文獻(xiàn)，希望對(duì)你有用！ http://www.brsbox.com/filebox/do ... bb709669d685b9821b5 http://www.brsbox.com/filebox/do ... ecc8279a5e96268b0e0 |
4樓2010-07-09 17:27:20
mgangle
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2樓2010-07-09 14:29:58
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vivihao(金幣+3):首先謝謝您回帖，我覺(jué)得您理解的可能有些偏差，好像是一個(gè)載體是P-nGFP-A,另一個(gè)載體是P-cGFP-B,然后共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如果出現(xiàn)熒光說(shuō)明AB蛋白互作。我現(xiàn)在想知道是在GFP的那個(gè)位置斷開(kāi)融合AB蛋白序列？既然您實(shí)驗(yàn)室的人有做過(guò)的，還請(qǐng)幫我您了解下，不盛感激！ 2010-07-09 16:24:10
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其實(shí)我也沒(méi)有做過(guò)，只是實(shí)驗(yàn)室其他人干過(guò)，我是這樣理解的 如果你要驗(yàn)證A，B蛋白是否互作，那么你要構(gòu)建： nGFP+A，nGFP+B，cGFP+B，cGFP+A 然后去A，B載體兩兩組合。這樣我們連接的A，B蛋白都可以位于nGFP，cGFP的C端，不用再去考慮A，B蛋白是否會(huì)由于位置不同而導(dǎo)致不互作！ 我是這么理解的僅供參考！呵呵！ |
3樓2010-07-09 15:34:22
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