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tingspdf至尊木蟲 (著名寫手)
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定量PCR讀取熒光值的步驟需要保持多長時(shí)間？
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| 各位朋友好！最近做定量PCR遇到了點(diǎn)問題，儀器是ABI7300，在延伸步驟讀取熒光值會有非特征峰，所以想在后面加一步高溫步驟（約80-85度）讀取熒光值，想問一下通常這一步需要保持多長時(shí)間？謝謝！ |
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這樣是不行的哦。有非特異峰就代表有非特異擴(kuò)增，如果你是兩步法（退火、延伸用同一個(gè)溫度），可以改為傳統(tǒng)的三步法以增加特異性。也可以嘗試提高退火溫度。 如果你用的熒光染料是sybr green，只能在延伸結(jié)束時(shí)檢測熒光信號，額外增加一個(gè)專門檢測熒光的步驟是不可行的哦。 |
3樓2012-05-09 21:21:18
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小丹木木: 金幣+2, 斑斑太謙虛了 2012-05-12 15:43:57
tingspdf: 金幣+2, ★★★很有幫助, 72度讀熒光應(yīng)該可以避免引物二聚體的干擾吧？ 2012-05-12 22:19:56
小丹木木: 金幣+2, 斑斑太謙虛了 2012-05-12 15:43:57
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呵呵，不好意思，孤陋寡聞了，之前沒聽說過有這么做的  剛看了下天根的資料，有提到如果有引物二聚體怎么處理，其中一個(gè)方法是“在延伸反應(yīng)結(jié)束之后加上一個(gè)溫度（高于引物二聚體解鏈溫度而低于目的片段解鏈溫度）延伸數(shù)秒。”我沒做過，引號內(nèi)是他們原文哈。 下面是個(gè)人看法，歡迎各位指正： 我想這跟你打算用的方法應(yīng)該是一個(gè)意思吧。原理我想應(yīng)該是這樣：Sybr Green只能檢測雙鏈，所以提高溫度讓非特異結(jié)合解鏈而保持目的片段不解鏈，這時(shí)候檢測熒光信號的話就沒有非特異產(chǎn)物的信號了。具體取幾度，應(yīng)該可以參照熔解曲線，取特異產(chǎn)物的峰和非特異產(chǎn)物的峰中間的溫度就可以了。至于時(shí)間，他們說幾秒鐘，個(gè)人認(rèn)為是合理的：很多PCR程序的變性時(shí)間只需要20秒左右，非特異產(chǎn)物結(jié)合的強(qiáng)度肯定不及模板（因?yàn)檫h(yuǎn)遠(yuǎn)比模板短），模板解鏈需要的時(shí)間都這么短，要搞定非特異產(chǎn)物幾秒鐘應(yīng)該足矣。 如果還是不行，建議還是換引物吧。 [ Last edited by 西瓜 on 2012-5-12 at 15:56 ] |
9樓2012-05-12 15:39:48
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