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[交流] 【求助/交流】在真菌基因組中PCR基因，難嗎？已有10人參與

我提取黑曲霉基因組，PCR三段片段，分別為6kb，6kb，1.6kb。結(jié)果都是雜帶，沒(méi)有目的帶。
而我以大腸基因組為模板PCR一段基因，卻非常順利。
是黑曲霉PCR引物我設(shè)計(jì)的不好？還是真菌基因組為模板的PCR本身就不好做？

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1樓 2010-07-30 11:28:05

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qingxiong

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是不是擴(kuò)增的片段太長(zhǎng)了呢？

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2樓2010-07-30 12:00:24

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又或者是真菌模板質(zhì)量不好呢，擴(kuò)不出來(lái)有很多原因的，擴(kuò)增體系，擴(kuò)增條件優(yōu)化了沒(méi)有呢？

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3樓2010-07-30 12:01:36

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Originally posted by qingxiong at 2010-07-30 12:01:36:
又或者是真菌模板質(zhì)量不好呢，擴(kuò)不出來(lái)有很多原因的，擴(kuò)增體系，擴(kuò)增條件優(yōu)化了沒(méi)有呢？

基因組好像提得不好，量很少。做過(guò)退火溫度梯度和模板濃度梯度，都沒(méi)有目的帶。雜帶是在退火溫度低、模板濃度大的時(shí)候比較亮。
覺(jué)得主要還是引物的問(wèn)題？關(guān)鍵是目的帶就沒(méi)有，雜帶還挺亮的。很郁悶。

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4樓2010-07-30 12:37:25

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哈，你PCR的模板濃度優(yōu)化了嗎？太高時(shí)擴(kuò)不出的
再就是你的模板質(zhì)量怎么樣，蛋白質(zhì)不要緊不大影響，但是絕對(duì)不能有苯酚等有機(jī)試劑

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5樓2010-07-30 12:45:18

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Originally posted by hyhyyl at 2010-07-30 12:45:18:
哈，你PCR的模板濃度優(yōu)化了嗎？太高時(shí)擴(kuò)不出的
再就是你的模板質(zhì)量怎么樣，蛋白質(zhì)不要緊不大影響，但是絕對(duì)不能有苯酚等有機(jī)試劑

把提的基因組，做了10倍和100倍稀釋，發(fā)現(xiàn)10倍的雜帶更亮一些，可能是基因組提的不大好，量比較少。
基因組是用試劑盒提的，不過(guò)試劑盒好像過(guò)期了。苯酚應(yīng)該沒(méi)有。

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6樓2010-07-30 12:52:37

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陳思容

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首先考慮模板問(wèn)題，個(gè)人認(rèn)為一般是模板問(wèn)題，引物一般沒(méi)什么太大問(wèn)題，建議你用降落PCR來(lái)做。。。

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7樓2010-07-30 15:21:11

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Originally posted by 陳思容 at 2010-07-30 15:21:11:
首先考慮模板問(wèn)題，個(gè)人認(rèn)為一般是模板問(wèn)題，引物一般沒(méi)什么太大問(wèn)題，建議你用降落PCR來(lái)做。。。

好的，我重新提一次基因組再做一下

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8樓2010-07-30 16:34:27

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xp198766

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做做全細(xì)胞試試，有同學(xué)有把一個(gè)蟲(chóng)子扔進(jìn)去，P出來(lái)的！這樣比較快……再提DNA……

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9樓2010-07-30 16:44:35

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陳思容

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Originally posted by ap at 2010-07-30 16:34:27:

好的，我重新提一次基因組再做一下

最好把你之前提DNA跑的電泳圖發(fā)上來(lái)看看

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10樓2010-07-30 16:47:23

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