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小凡198807木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】同工酶試驗中的一些問題 已有3人參與
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下面是我查文獻(xiàn)查到的總蛋白提取,淀粉酶同工酶和酯酶的提取方法： 總蛋白分析 茶薪菇成菇、幼菇、原基、菌絲, 雪蓮菇成菇、菌絲, 各取少量, 加生理鹽水, 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理, 4 ℃下7 000 rpm 離心10 min , 分離上清液。取一定體積樣品液(內(nèi)含50μL 總蛋白) ,加入2 倍樣品溶解液(2 %SDS、2 %巰基乙醇、20 %甘油、0.04 %溴酚藍(lán)、0.02 mol/L pH 8.0 Tris - HC1 緩沖液) 于100 ℃水浴中保溫3 min。聚丙烯酰胺垂直板電泳, 濃縮膠濃度為3 % , 分離膠濃度為7.5 % , 電極緩沖液為pH 8.3 的Tris - 甘氨酸電極緩沖液。在濃縮膠時, 電流穩(wěn)流為12 mA , 進(jìn)入分離膠后, 調(diào)至穩(wěn)流18 mA。電泳結(jié)束后用45.4 %甲醇- 9.2 %冰乙酸混合液固定1 h , 用0.05 % (WPV) 考馬斯亮藍(lán)R - 250 冰乙酸甲醇水染色液染色過夜, 用5 %甲醇- 7.5 %冰乙酸混合液洗脫2～3 次。 淀粉酶同工酶分析 樣品制備與上面 大致相同, 只是以雙蒸水代替其中的SDS。 聚丙烯酰胺垂直板電泳, 濃縮膠濃度為3 % , 分離膠濃度為7 % , 電極緩沖液為pH 8.3 的Tris - 甘氨酸電極緩沖液, 在4 ℃下, 穩(wěn)定電壓20 vPcm 時電泳。電泳結(jié)束, 將膠板小心置于200 mL 0.15 molPL 的醋酸緩沖液(pH 5.0) 中, 在37 ℃保溫1.5 h。倒去保溫液, 用0.15 molPL 醋酸緩沖液(pH 5.0) 沖洗膠板上多余的淀粉, 然后用稀釋20 倍的顯色碘液染色, 膠板逐漸變成藍(lán)色, 在藍(lán)色背景上出現(xiàn)各種透明條帶,即淀粉酶帶。 酯酶同工酶的研究 樣品制備:稱取一定量的不同發(fā)育期的菌體,按1∶2 ( g/mL) 加入冰凍0. 1 mol/ L 磷酸緩沖液(pH 7. 4) ,加少許石英砂于研缽中,研磨至糊狀,4 ℃中13 000 r/min 離心10 s ,取上清液,按1∶1 滴加0. 05 %溴酚藍(lán)- 25 %蔗糖液,攪勻備用。 電泳:采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳法。分離膠濃度8. 7 % ,交聯(lián)度2. 5 % ,濃縮膠濃度1. 9 % ,交聯(lián)度5 %。每孔加樣量30 μL ,電極緩沖液為Tris -Gly 系統(tǒng)(pH 8. 3) ,4 ℃下電泳,起始穩(wěn)壓200 V ,待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后,電壓調(diào)至360 V ,電泳3 h 結(jié)束。 染色:EST 同工酶染色參照Shaw[6 ]方法進(jìn)行。 固定、保存:待染色的酶帶清晰后,蒸餾水漂洗,7.5 %醋酸- 30 %乙醇- 15 %甘油固定,保存,制成干片。 最后，問題就是第一個總蛋白提取里面2 倍樣品溶解液(2 %SDS、2 %巰基乙醇、20 %甘油、0.04 %溴酚藍(lán)、0.02 mol/L pH 8.0 Tris - HC1 緩沖液) 這個溶解液的配方是什么，比例多少？有相關(guān)的茶樹菇總DNA提取或者同工酶試驗的整體方案也行。 另外酯酶實驗里面的染色方法有人知道怎么染色嗎？該文獻(xiàn)染色引用的是Starch Gel Electrophoresis of EnzymesmA Compilation of Recipes這篇文章。希望能告訴我染色方法。謝謝了。 食用菌的同工酶標(biāo)記方法有的話也可以發(fā)上來啊，多謝多謝。 有哪位大哥看的懂的話告訴小弟一聲，小弟不勝感激，金幣是不會少的，能盡快解決的話，還是要靠各位大哥，拜謝拜謝·~·最近需要做這個實驗~~ |
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