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qzhaiyan木蟲 (著名寫手)
小胖子
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[交流]
【求助/交流】Ni柱洗脫蛋白
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| 我的蛋白以前都是用10和20mM咪唑洗雜蛋白，然后用250mM咪唑洗脫目的蛋白，效果很好。最近不知道為什么我的蛋白在10和20mM咪唑下就洗脫下來了，很奇怪。哪位高手指點一下！ |
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2樓2010-08-11 16:24:26
jasco
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5樓2010-08-12 09:12:17
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6樓2010-08-12 09:18:54
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qzhaiyan(金幣+1): 2010-08-12 11:01:33
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有些蛋白確實會存在這樣的情況，在低濃度的咪唑下就會被洗脫下來，跟柱料還有你的蛋白都有關(guān)系。你可以這樣做，用不含咪唑的binding buffer一直沖洗，知道非特異性結(jié)合的蛋白都被清洗干凈，然后10 mM接0.5ml,20 mM接1ml，50 mM接1ml,直接250mM接上3-5管，然后都去跑SDS-PAGE去檢測那一管比較純。在低濃度咪唑條件下，雜蛋白還有你的目的蛋白都會被洗脫下來，因此，洗脫的體積要少，不能太多，否則你的蛋白都損失了，這部的目的為了去除雜蛋白。高濃度下收集你的樣品，都搜集，然后看看那一管比較純。 另外提醒：你這個蛋白是不是沉淀里面表達(dá)？如果是，你在洗脫的時候是不是沒有加urea or sarkosyl?如果沒有加，目的蛋白重新沉淀，直接從柱子上掉下來。 |
7樓2010-08-12 09:29:28
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