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dongfangzz

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[交流] 【求助/交流】PCR之后的產(chǎn)物與設(shè)計引物時產(chǎn)物的大小不符？已有5人參與

我要做實時熒光定量PCR，提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄之后，以cDNA為模板PCR（引物是以mRNA序列設(shè)計的）。 PCR之后的產(chǎn)物跑電泳時與設(shè)計引物時產(chǎn)物的大小不符。設(shè)計引物時產(chǎn)物應(yīng)為170bp, 而實際產(chǎn)物為200多個bp。
這是怎么回事？
marker為DL1000DNA，共7個帶（100、200、300、400、500、700、1000）

連接看不到，再來一個。
http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=98985479lxqhk563rrgo7vt

不知是不是和RNA降解有關(guān)系?
先謝謝大家了!

[ Last edited by dongfangzz on 2010-9-14 at 23:44 ]

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1樓 2010-09-11 11:44:47

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won7

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設(shè)計引物時預(yù)期的長度應(yīng)該包括引物的部分，你說的170bp是否包括了引物？

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2樓2010-09-11 16:50:27

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我不知道呀，公司用primer3.0給設(shè)計的。設(shè)計后直接把文本文檔給發(fā)過來了，讓我比對。里面信息挺全的,。有一項說product size: 170.
部分原文件：
ADDITIONAL OLIGOS
                              start  len    tm    gc% any 3' seq
2 LEFT PRIMER       184 20 60.11 55.00  2.00  1.00 gaccctgccttaccaactca
RIGHT PRIMER    353 20 61.55 60.00  5.00  0.00 cactgtggagacgcccatac
PRODUCT SIZE: 170, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 0.00

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3樓2010-09-11 17:02:57

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看樣子，預(yù)期是應(yīng)該170bp，你換個公司的MARKER再跑電泳看看，是不是不同公司的MARKER的錯誤。

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4樓2010-09-11 19:39:48

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一切都是有可能的，很多人都跑不出條帶，熒光PCR依舊很棒。不能太拘泥這個。跟模板有關(guān)系，很有可能你遇到的是個缺失的那個，可以測序。

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供應(yīng)PCR增量劑

5樓2010-09-12 09:55:04

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有時候會大會小，沒有關(guān)系

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一念起，萬水千山；一念滅，滄海桑田！

6樓2010-09-12 10:27:20

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我不知道這樣的結(jié)果能不能用.
我著方面了解的少．我推測原因至少有２個:
1. 引物的問題.我當(dāng)時合成了幾個基因的引物,公司包裝時把引物給裝錯了管子;
2. marker的問題．
肯定還有其他可能．

不知大家有沒有個系統(tǒng)的解釋呀?
謝謝！

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7樓2010-09-12 15:24:31

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yangjie86

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樓主，你做的熒光定量PCr是用探針還是染料的，你的引物都是公司給設(shè)計的嗎？我也要做所以想交流一下了。

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莫回頭看背后的身影。

8樓2010-09-13 14:09:41

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