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biolinshen

銀蟲 (初入文壇)

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[交流] 【求助/交流】請(qǐng)教：DNA濃度測(cè)定已有4人參與

手頭有酶切后切膠純化（OMEGA）樣品兩份，用于qPCR定量。所以要求對(duì)純化后樣品精確定量。100倍稀釋后，測(cè)定濃度。手頭兩臺(tái)DNA濃度分光光度計(jì)，一臺(tái)Eppendorf 的，一臺(tái)島津的。對(duì)兩份樣品測(cè)定得出的濃度差異很大（35， 0） vs (100, 45) 最主要問(wèn)題還在于A 樣本跑膠條帶亮度遠(yuǎn)小于B樣品。另外A260 /A 280 遠(yuǎn)小于 1.8. 我的問(wèn)題

1. 有什么辦法可以更好去除DNA樣品中蛋白等雜質(zhì)呢？我提取的質(zhì)粒DNA, 酶切后進(jìn)行膠純化，難道還不能保證DNA的純度？

2. 紫外分光光度計(jì)，對(duì)DNA濃度的測(cè)定準(zhǔn)確度如何？問(wèn)了不少人，似乎對(duì)其精度都表示懷疑。

對(duì)各位的建議，謝過(guò)先！

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1樓 2010-09-11 19:41:29

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biolinshen

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感謝priorpost06 的熱情幫忙哈。因?yàn)楸旧鞤NA濃度不是很高，蠻擔(dān)心再苯酚氯仿之后，就沒(méi)剩多少了。看了島津的說(shuō)明書，檢測(cè)限說(shuō)是上樣濃度>2 微升。所以降低稀釋倍數(shù)，使上樣濃度提高到檢測(cè)限上。再次用島津和Eppendorf測(cè)定，兩者值基本一致。但蛋白雜質(zhì)還是存在且不低，看來(lái)還得先大量富集之后再酚純化了。再次感謝各位的幫助

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9樓2010-09-15 11:24:29

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不知道頂一下希望有人能夠幫助

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戒嗔怒以養(yǎng)肝氣，省言語(yǔ)以養(yǎng)神氣，多讀書以養(yǎng)質(zhì)氣，順時(shí)令以養(yǎng)元?dú)猓痪泄?jié)以養(yǎng)大氣，觀天變以養(yǎng)靈氣，莫強(qiáng)求規(guī)于運(yùn)氣。

2樓2010-09-11 20:34:56

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girlfisher

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biolinshen(金幣+2): 2010-09-12 19:49:07

切膠純化然后又稀釋100倍，這種情況一般你的DNA含量低于1ng/uL，用分光光度計(jì)已經(jīng)完全不準(zhǔn)了。
至少也要用原始樣品在低樣品消耗的nanodrop上測(cè)含量，不過(guò)還是建議用內(nèi)參來(lái)定量或者用更加準(zhǔn)確的Qubit方法確定模板含量。

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3樓2010-09-11 20:54:08

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感謝這位，你的回答給我很大的幫助。

引用回帖:

Originally posted by girlfisher at 2010-09-11 20:54:08:
切膠純化然后又稀釋100倍，這種情況一般你的DNA含量低于1ng/uL，用分光光度計(jì)已經(jīng)完全不準(zhǔn)了。
至少也要用原始樣品在低樣品消耗的nanodrop上測(cè)含量，不過(guò)還是建議用內(nèi)參來(lái)定量或者用更加準(zhǔn)確的Qubit方法確定模板 ...

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5樓2010-09-12 19:50:22

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