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Ella14銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】大家酶切載體怎么切？一般切多久？ 已有4人參與
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| 大家酶切載體怎么切？一般切多久？最近挑克隆總是不見陽性的。做了載體對(duì)照，張得很好，1UG，1U的酶，切過夜。。。去磷。。。 |
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2樓2010-10-12 03:21:22
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4樓2010-10-12 08:39:01
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dhd997(金幣+1):謝謝交流。 2010-10-13 08:39:19
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dhd997(金幣+1):謝謝交流。 2010-10-13 08:39:19
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挑克隆沒有陽性的話，要分你酶切之后是否切膠回收了 如果切膠回收了，那假陽性應(yīng)該是載體自連引起的，可能是去磷酸化不完全 如果沒有切膠回收，直接拿酶切體系純化后做連接，那么沒切開和自連都有可能導(dǎo)致假陽性。區(qū)分方法就是用酶切產(chǎn)物直接做轉(zhuǎn)化，如果也長，就說明有剩余沒切開的質(zhì)粒，要延長酶切時(shí)間（如果已經(jīng)切過夜，應(yīng)該不是時(shí)間問題）、加大酶量，或者檢查一下酶切體系離子濃度或者酶切溫度是否有問題；如果不長，那就還是自連引起的 至于載體和片段比例，對(duì)于去磷酸化或者雙酶切的載體來說，沒必要十分嚴(yán)格。至少我基本上就不會(huì)去關(guān)心濃度比，只要載體和片段質(zhì)量過關(guān)，并且有一定的量，理論上不會(huì)出問題 |
5樓2010-10-12 12:39:36
Ella14
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6樓2010-10-12 12:59:53
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7樓2010-10-13 02:00:10
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